Реакция №3 «Осаждение солями тяжелых металлов»
ХИМИЯ БЕЛКОВ
Для обнаружения и изучения химического состава белков существует две группы реакций: цветные и реакции осаждения.
Цветные реакции
Цветные реакции применяются для установления белковой природы вещества, идентификации белков и определения их аминокислотного состава в различных биологических жидкостях. В клинической лабораторной практике эти методы используются для определения количества белка в плазме крови, аминокислот в моче и крови, для выявления наследственных или приобретенных нарушений обмена веществ у новорожденных.
Реакция №1 «Биуретовая реакция на пептидную связь»
Принцип: в основе биуретовой реакции лежит способность пептидных связей (-СО-NH-) образовывать с сульфатом меди в щелочной среде окрашенные комплексные соединения, интенсивность окраски которых зависит от длины полипептидной цепи. Раствор белка дает сине-фиолетовое окрашивание.
Реактивы: 1) яичный белок, 1% раствор (белок куриного яйца фильтруют через марлю и разводят дистиллированной водой 1:10); 2) гидроокись натрия, 10% раствор; 3) сульфат меди, 1% раствор.
Ход определения: в пробирку вносят 5 капель раствора яичного белка, 3 капли гидроокиси натрия и 1 каплю сульфата меди, перемешивают. Содержимое пробирки приобретает сине-фиолетовое окрашивание.
Реакция №2 «Нингидриновая реакция»
|
|
|
Принцип: сущность реакции состоит в образовании соединения, окрашенного в сине-фиолетовый цвет, состоящего из нингидрина и продуктов гидролиза аминокислот. Эта реакция характерна для аминогрупп в α-положении, которые присутствуют в природных аминокислотах и белках.
Реактивы: 1) яичный белок, 1% раствор; 2) нингидрин, 0,5% водный раствор.
Ход определения: в пробирку вносят 5 капель раствора яичного белка, добавляют 5 капель раствора нингидрина и нагревают до кипения. Развивается розово-фиолетовое окрашивание, переходящее с течением времени в сине-фиолетовое.
Реакция №3 «Ксантопротеиновая реакция»
Принцип: при добавлении к раствору белка концентрированной азотной кислоты и нагревании появляется желтое окрашивание, которое в присутствии щелочи переходит в оранжевое. Сущность реакции заключается в нитровании бензольного кольца циклических аминокислот азотной кислотой с образованием нитросоединений, выпадающих в осадок. Реакция выявляет наличие в белке циклических аминокислот (фенилаланин, тирозин, триптофан).
Реактивы: 1) яичный белок, 1% раствор; 2) концентрированная азотная кислота; 3) гидроокись натрия, 10% раствор.
|
|
|
Ход определения: к 5 каплям раствора яичного белка добавляют 3 капли азотной кислоты и (осторожно!) нагревают. Появляется осадок желтого цвета. После охлаждения добавляют (желательно на осадок) 10 капель раствора гидроокиси натрия, появляется оранжевое окрашивание.
Реакция №4 «Реакция Адамкевича»
Принцип: аминокислота триптофан в кислой среде, взаимодействуя с альдегидами кислот, образует продукты конденсации красно-фиолетового цвета.
Реактивы: 1) неразбавленный яичный белок; 2) концентрированная (ледяная) уксусная кислота; 3) концентрированная серная кислота.
Ход определения: к одной капле белка прибавляют 10 капель уксусной кислоты. Наклонив пробирку, осторожно по стенке добавляют каплями около 0,5 мл серной кислоты так, чтобы жидкости не смешивались. При стоянии пробирки на границе жидкостей появляется красно-фиолетовое кольцо.
Реакция №5 «Реакция Фоля»
Принцип: аминокислоты, содержащие сульфгидрильные группы – SH, подвергаются щелочному гидролизу с образованием сульфида натрия Na2S. Последний, взаимодействуя с плюмбитом натрия (образуется в ходе реакции между ацетатом свинца и гидроокисью натрия), образует осадок сульфида свинца PbS черного или бурого цвета.
|
|
|
Na2S + Na2PbO2 + 2H2O PbS + 4 NaOH
Реактивы: 1) яичный белок, 1% раствор; 2) реактив Фоля (к 5% раствору ацетата свинца прибавляют равный объем 30% раствора гидроокиси натрия до растворения образовавшегося осадка).
Ход определения: к 5 каплям раствора яичного белка прибавляют 5 капли реактива Фоля и кипятят 2-3 минуты. После отстаивания 1-2 минут появляется черный или бурый осадок.
Реакции осаждения
Белки в растворе и соответственно в организме сохраняются в нативном (природном) состоянии за счет факторов устойчивости, к которым относятся заряд белковой молекулы и гидратная (водная) оболочка вокруг нее. Удаление этих факторов приводит к склеиванию молекул и выпадению их в осадок. Осаждение белков может быть обратимым и необратимым в зависимости от состава реактивов и условий реакций. В клинической лабораторной практике реакции осаждения используют для выделения альбуминовой и глобулиновой фракций (групп) белков плазмы крови, количественной характеристики их устойчивости в плазме, обнаружения белков в биологических жидкостях и освобождения от них с целью получения безбелкового раствора.
|
|
|
Обратимое осаждение
Под действием факторов осаждения белки выпадают в осадок, но после прекращения действия (удаления) этих факторов белки вновь переходят в растворимое состояние и приобретают свои нативные свойства. Одним из видов обратимого осаждения белков является высаливание.
Реакция №1 «Высаливание»
Принцип: насыщенным раствором сульфата аммония осаждается альбуминовая фракция белков, полунасыщенным раствором сульфата аммония – глобулиновая фракция.
Сущность реакции заключается в дегидратации (обезвоживании) молекул белка.
Реактивы:1) неразбавленный яичный белок; 2) насыщенный раствор сульфата аммония; 3) гидроокись натрия, 10% раствор; 4) сульфат меди, 1% раствор; 5) сульфат аммония в порошке; 6) дистиллированная вода.
Ход определения: в пробирку наливают 30 капель неразведенного яичного белка и добавляют равное количество насыщенного раствора сульфата аммония. Содержимое пробирки перемешивают. Получают полунасыщенный раствор сульфата аммония, при этом глобулиновая фракция белка осаждается, а альбуминовая остается в растворе. Через 5 минут осадок отфильтровывают, на фильтре остается глобулиновая фракция, а в фильтрате – альбуминовая. Осадок с фильтрата снимают стеклянной палочкой и переносят в пробирку, куда добавляют несколько капель воды, пока не растворится осадок. Наличие в растворе белка можно доказать с помощью биуретовой реакции, которая будет положительной.
В пробирку с фильтратом добавляют порошок сульфата аммония до полного насыщения раствора, т.е. до тех пор, пока не прекратится растворение соли. При этом выпадает осадок – альбумины. Его отфильтровывают, осадок с фильтра снимают стеклянной палочкой, растворяют водой и проводят биуретовую реакцию.
Необратимое осаждение
Необратимое осаждение белков связано с глубокими нарушениями структуры белков (вторичной и третичной) и потерей ими своих нативных свойств, т.е. денатурацией. Такие изменения белков можно вызывать кипячением, действием концентрированных растворов минеральных и органических кислот, солями тяжелых металлов и т.д.
Реакция №2 «Осаждение при кипячении»
Принцип: белки являются термолабильными соединениями и при нагревании свыше 50-600С денатурируются. Сущность тепловой денатурации заключается в разрушении гидратной оболочки, разрыве стабилизирующих белковую молекулу связей и развертывании белковой молекулы. Наиболее полное и быстрое осаждение происходит в изоэлектрической точке (когда заряд молекулы равен нулю), поскольку при этом частицы белка наименее устойчивы. Белки, обладающие кислыми свойствами, осаждаются в слабокислой среде, а белки с основными свойствами – в слабощелочной. В сильнокислых или сильнощелочных растворах денатурированный при нагревании белок в осадок не выпадает, т.к. его частицы перезаряжаются и несут в первом случае положительный, а во втором – отрицательный заряд, что повышает их устойчивость в растворе.
Реактивы: 1) яичный белок, 1% раствор; 2) уксусная кислота, 1% и 10% растворы; 3) гидроокись натрия, 10% раствор.
Ход определения: в 4 пронумерованные пробирки приливают по 10 капель раствора яичного белка. Затем 1-ю пробирку нагревают до кипения, при этом раствор белка мутнеет, но так как частицы денатурированного белка несут заряд, они в осадок не выпадают. Это связано с тем, что яичный белок имеет кислые свойства (изоэлектрическая точка его рН 4,8) и в нейтральной среде заряжен отрицательно. Во 2-ю пробирку добавляют 1 каплю 1% раствора уксусной кислоты и нагревают до кипения. Белок выпадает в осадок, так как его раствор приближается к изоэлектрической точке и белок теряет заряд (один из факторов устойчивости белка в растворе). В 3-ю пробирку добавляют 1 каплю 10% уксусной кислоты и нагревают до кипения. Осадка не образуется, так как в сильнокислой среде частицы белка приобретают положительный заряд (сохраняется один из факторов устойчивости белка в растворе). В 4-ю пробирку добавляют 1 каплю раствора гидроокиси натрия и нагревают до кипения. Осадок не образуется, поскольку в щелочной среде отрицательный заряд частиц белка увеличивается.
Реакция №3 «Осаждение солями тяжелых металлов»
Принцип: белки при взаимодействии с солями свинца, меди, ртути, серебра и других тяжелых металлов денатурируются и выпадают в осадок. Однако при избытке некоторых солей наблюдается растворение первоначально образовавшегося осадка. Это связано с накоплением ионов металла на поверхности денатурированного белка и появлением положительного заряда на белковой молекуле.
Реактивы: 1) яичный белок, 1% раствор; 2) сульфат меди, 10% раствор; 3) ацетат свинца, 5% раствор, 4) нитрат серебра, 5% раствор.
Ход определения: в 3 пронумерованные пробирки вносят по 5 капель раствора яичного белка. В 1-ю пробирку добавляют 1 каплю сульфата меди. Во 2-ю пробирку добавляют 1 каплю ацетата свинца. В 3-ю пробирку добавляют 1 каплю нитрата серебра. Во всех пробирках выпадает осадок. Затем в первую пробирку добавляют 10 капель сульфата меди и во вторую пробирку добавляют 10 капель ацетата свинца и наблюдают растворение осадка. В третью пробирку вносят 10 капель нитрата серебра – растворение осадка нет.
Дата добавления: 2018-05-12; просмотров: 2545; Мы поможем в написании вашей работы! |
Мы поможем в написании ваших работ!