Ошибки постаналитического этапа



Лекция 17

Методы молекулярно-генетического исследования.

Принцип работы при выполнении ПЦР анализа.

Полимеразная цепная реакция (англ. — PCR — polymerase chain reaction) была открыта Кэри Б. Мюллисом в 1983 году, за что он был удостоен Нобелевской премии.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) — это метод, который позволяет найти в исследуемом клиническом материале небольшой участок генетической информации (ДНК/РНК) инфекционного возбудителя, многократно его размножить и выявить с помощью различных современных технологий (гибридизационно-флюоресцентная детекция в режиме «реального времени» и «по конечной точке»).

В настоящее время ПЦР является одним из высокочувствительных методов диагностики инфекционных заболеваний, который позволяет выявлять единичные вирусные частицы или бактериальные клетки.

Молекулярно-генетические методы позволяют анализировать фрагменты ДНК, находить и изолировать отдельные гены и их сегменты и устанавливать в них последовательность нуклеотидов.

Для правильной работы ПЦР лаборатории необходимо соблюдать требования к помещениям лаборатории, выполняющей молекулярно-биологические диагностические исследования.

Лаборатория в соответствии с этапами проведения анализа должна включать:

u Рабочая зона 1 - зона приема, регистрации, разбора и первичной обработки материала

u Рабочая зона 2 – зона выделения нуклеиновых кислот

u Рабочая зона 3 - зона проведения реакции амплификации и учета ее результатов при использовании гибридизационо – флуоресцентного метода детекции

u Рабочая зона 4-1 – зона учета результатов реакции амплификации нуклеиновых кислот методом электрофореза и (или) гибридизационно - ферментным методом детекции

u Рабочая зона 4-2 – зона учета результатов (детекции) продуктов амплификации нуклеиновых кислот методом секвенирования и (или) на ДНК-чипах.

Важным этапом работы лаборатории должно быть проведение контроля качества.

Внутрилабораторный:

· ВК

1.Представляет собой альтернативную ПЦР-систему – свои праймеры, своя ДНК-матрица

2.Эффективность удаления ингибиторов ПЦР

3.Качество работы персонала

4.Позволяет оценить прохождение реакции в ОТРИЦАТЕЛЬНЫХ пробах

 

· «К-» Образец, в котором заведомо нет ДНК исследуемого микроорганизма

 

1.Вводится на стадии выделения ДНК/РНК

2.Позволяет оценить наличие контаминации ампликонами и кросс-контаминации между образцами

3. Позволяет оценить все исследование

 

· «К+»

 

1.Образец, содержащий фрагмент ДНК исследуемого микроорганизма

2. Вводится на стадии амплификации

3. Позволяет оценить работоспособность тест-системы

· Специальные контроли (определение абсолютной концентрации)

 

· Смывы с поверхностей

 

1.Исследования смывов с рабочих поверхностей на наличие ДНК микроорганизмов

2.Оценка контаминации

3.Оценка сан.эпид. режима

· Участие во внешнем контроле качества.

 

1. ФСВОК и др.

2. Зашифрованные панели, содержат отрицательные и положительные образцы

Этапы ПЦР.

Амплификация -многократное увеличение числа копий фрагмента нуклеиновых кислот (ДНК/(кДНК)/РНК) или усилении сигнала в условиях in vitro, что позволяет обнаружить специфичный участок генома возбудителя с целью его идентификации

Методы амплификации нуклеиновых кислот:

u Полимеразная цепная реакция (ПЦР)

u Реакция амплификации на основе нуклеотидной последовательности нуклеиновых кислот (NASBA)

u Лигазная цепная реакция (ЛЦР)

u Амплификация с удалением (вытеснением) цепи (SDA)

u Транскрипционно – опосредованная амплификация (TMA)

u Реакция изотермальной транскрипционной амплификации (TAS)

u Самоподдерживающаяся реакция репликации последовательностей (SSSR или 3SR)

u Амплификации по типу катящегося кольца (RCA) и т.д.

Метод клонирования ДНК позволяет изолировать отдельные гены или их части, создавать неограниченное количество их копий, транскрибировать и транслировать изолированные гены, что стало возможным благодаря открытию ферментов-рестриктаз. Эти ферменты «узнают» специфическую олигонуклеотидную последовательность в двухнитевой ДНК и разрезают ее в данном месте — сайте. Разные рестриктазы распознают различные последовательности нуклеотидов и разрезают ДНК в разных сайтах. В последние годы для получения достаточного количества фрагментов ДНК используется полимеразная цепная реакция — метод амплификации ДНК в условиях in vitro. В течение нескольких часов можно размножить ДНК в количестве, превышающем исходное в миллионы раз.

Методы детекции продуктов амплификации нуклеиновых кислот:

u  Электрофоретический (в агарозном или полиакриламидном геле)

u  Гибридизационно - ферментный

u  Гибридизационо – флуоресцентный (детекция продукта в режиме «реального времени» или регистрация продукта после окончания реакции амплификации «анализ по конечной точке»

Форматы исследования:

u  Качественный

u  Количественный

Методы гибридизации нуклеиновых кислот. После разрезания ДНК на фрагменты рестриктазами проводится их электрофорез на агарозном или полиакриламидном геле с целью разделения этих фрагментов. Далее осуществляется идентификация фрагментов ДНК.

Для выявления специфических фрагментов ДНК используется метод блот-гибридизации по Саузерну. Эта методика состоит из следующих этапов:

1) после окончания электрофореза гели помещают в щелочной раствор для денатурации фрагментов ДНК — получают одноцепочечные ДНК;

2) одноцепочечные ДНК вымывают из геля на нитроцеллюлозный или нейлоновый фильтры перпендикулярным поверхности геля током буфера; одноцепочечные фрагменты ДНК фиксируют на фильтре;

3) для визуального выявления нужных фрагментов проводят гибридизацию исследуемого образца со специфическим по нуклеотид-ной последовательности меченным радиоактивно или флюоресцентной меткой олигонуклеотидным синтетическим зондом; радиоактивно меченные участки выявляют путем экспонирования фильтра с рентгеновской пленкой (ауторадиография); флюоресцентные метки выявляют в люминесцентном микроскопе.

Этот метод позволяет обнаружить единственный ген среди десятков тысяч. Гомологичные последовательности можно идентифицировать как полностью, так и частично. Различные модификации этого метода позволяют в клинике анализировать очень малые количества ДНК, взятые у больного.

Обязательные компоненты:

u ДНК-матрица, содержащая тот участок ДНК, который требуется амплифицировать

u Праймеры, комплементарные противоположным концам разных цепей требуемого фрагмента ДНК.

u Термостабильная ДНК-полимераза - фермент, который катализирует реакцию полимеризации ДНК. Полимераза для использования в ПЦР должна сохранять активность при высокой температуре длительное время, поэтому используют ферменты, выделенные из термофилов — Thermus aquaticus (Taq-полимераза), Pyrococcus furiosus (Pfu-полимераза), Pyrococcus woesei (Pwo-полимераза) и другие.

u Дезоксирибонуклеозидтрифосфаты (dATP, dGTP, dCTP, dTTP).

u Ионы Mg2+, необходимые для работы полимеразы.

u Буферный раствор, обеспечивающий необходимые условия реакции — рН,ионную силу раствора. Содержит соли, БСА.

u Чтобы избежать испарения реакционной смеси, в пробирку добавляют высококипящее масло, например, вазелиновое. Если используется амплификатор с подогревающейся крышкой, этого делать не требуется.

Дополнительные компоненты:

ВК

ДНК-зонды

Ошибки преаналитического этапа:

- Неправильный выбор места взятия биологического материала для исследования

- Исследование «универсального материала»

- Неправильное взятие материала на исследование (должны быть: максимальная концентрация микроорганизмов в образце, а также отсутствие нежелательных примесей, ингибирующих ПЦР)

- Обработка биологического материала

- Хранение биологического материала

Ошибки аналитического этапа

- Неправильный выбор системы пробоподготовки

-Неправильно приготовленные фоновые пробирки для тест-систем с флуоресцентной детекцией по конечной точке (обязательно менять фоновые пробирки при появлении новой серии реактивов; не добавлять в фоновые пробирки полимеразу)

- Контаминация

- Ложноположительные / ложноотрицательные результаты

Детекция с использованием гель-электрофореза:

а) Риск принять неспецифические фрагменты за специфичные, если они близки по длине и нет возможности сравнить с К+ и маркером длин фрагментов.

б) Нанесение образцов одним наконечником, если он плохо промывался или одна из проб оказалась с очень высокой концентрацией ДНК.

Ошибки постаналитического этапа

 - Неверная интерпретация врачом результатов ПЦР-анализа вследствие ошибочных представлений об инфекционном агенте или о возможностях метода

 Необходимо учитывать:

- специфичность используемых тест-систем (видо- и родоспецифичные, возможность выявления близкородственных групп)

- несовпадение результатов различных методов исследования (ПЦР/ИФА («иммунологический след» или «серологическое окно»), ПЦР/посев, ПЦР/микроскопия).

Особенности ПЦР анализа.

· Легкость взятия и транспортировки материала

· Для ряда инфекций зачастую является единственным методом диагностики (дети ВИЧ-инфицированных матерей)

· Нет накопления инфекционного агента

· Технология универсальна – позволяет определять инфекционные агенты, гены человека и ГМИ

·  Объективный результат

· Высокая чувствительность

 

 


Дата добавления: 2018-04-15; просмотров: 2105; Мы поможем в написании вашей работы!

Поделиться с друзьями:






Мы поможем в написании ваших работ!