ПРИНЦИП ГЕЛЬ-ФИЛЬТРАЦИИ (подробно в картинках)
РАЗДЕЛЕНИЕ БИОЛОГИЧЕСКИХ МОЛЕКУЛ
МЕТОДОМ ГЕЛЬ-ФИЛЬТРАЦИИ
Разделение молекул по размерам и форме основано на свойствах молекулярного сита, которыми обладают многие пористые материалы.
Наиболее часто для этой цели применяют органические полимеры с трехмерной сетчатой структурой, придающей им свойства гелей. Разделение веществ при помощи гелей, основанное на различиях в размере молекул, называется гель-фильтрацией.
Гель-фильтрацию открыли в 1959 Д. Порат и П. Флодин, которые показали возможность фракционирования водорастворимых макромолекул, в т. ч. белков, по молекулярной массе, в качестве сита они использовали сшитый декстрановый гель. В 1964 Д. Мур предложил с помощью гель-проникающей хроматографии определять молекулярную массу полимеров, фракционируя их на стирол-дивинилбензольном геле.
В качестве молекулярного сита также применяются пористые стеклянные гранулы, а сам метод разделения получил название хроматографии фильтрованием через стекло с заданным размером пор. Понятие проникающая хроматография включает в себя все виды разделения молекул, основанные на принципе молекулярного сита.
Принцип, лежащий в основе метода проникающей хроматографии, прост. Хроматографическую колонку заполняют набухшим гелем или
пористыми стеклянными шариками и уравновешивают с помощью соответствующего растворителя. Крупные молекулы, не проникающие в поры сита, проходят между частицами геля, в то время как небольшие молекулы «застревают» в них и движутся с меньшей скоростью.
|
|
Для гель-фильтрации применяют гели на основе декстрана (сефадекс), полиакриламида (акрилекс, биогель Р), агарозы (сефароза, биогель А, сагавак), полиакрилоилморфина (энзокрилгель), полистиролов (Био-Бидз S).
Гель образует неподвижную фазу, в которой с током буфера происходит разделение биологических молекул. Гель формируют в колонках, чаще стеклянных, различного размера и диаметра (в зависимости от цели эксперимента). Гель-хроматография на сефадексе используется для обессоливания растворов белков (разделение крупных белковых молекул и малых молекул солей), определения молекулярных масс белков, разделения сложных смесей макромолекул. Размер биологических молекул является главным фактором их эффективного разделения при движении в пористом геле. Гели, используемые для хроматографии, имеют разный размер пор, что позволяет делить вещества в широком диапазоне молекулярных масс ( 1000 — 1000000 дальтон). При прохождении через колонку геля смеси молекул разного размера крупные молекулы движутся быстрее, чем мелкие, так как последние за счет проникновения в пористые гранулы геля проходят более длинный путь. В конечном итоге компоненты смеси элюируются с колонки, наполненной гранулами геля,в порядке уменьшения их молекулярной массы. Для характеристики процесса гель-фильтрации используют понятия: свободный объем колонки (Vo) и объем элюции (Ve). Свободный объем определяют путем пропускания через колонку раствора «голубого декстрана» (высокомолекулярного вещества с массой 2 х 106 дальтон). Объем, с которым выходит пиковая концентрация голубого декстрана, называется свободным объемом колонки (Vo). Объем, с которым выходит пиковая концентрация разделяемого вещества, называется объемом элюции (Ve).
|
|
В этом простейшем варианте хроматографии молекулы фракционируемых веществ не должны обладать никаким специальным сродством к неподвижной или подвижной фазам. Неподвижная фаза здесь представлена жидкостью, находящейся внутри пористых гранул,— точно такой же, как и жидкость подвижной фазы, протекающей между ними. Благодаря силам сцепления с поверхностью пространственной сетки полимера или иного пористого материала, образующего гранулы, жидкость внутри них остается неподвижной и не увлекается течением подвижной фазы. В подавляющем большинстве случаев применения гель-фильтрации для биологических целей рабочей жидкостью служат водно-солевые растворы, а материалы гранул гидрофильны. Переход молекул вещества из подвижной фазы в неподвижную и обратно за счет диффузии ничем не затруднен. Иная ситуация складывается внутри гранул. Здесь диффузия более или менее затруднена из-за столкновений молекул диффундирующего вещества с нитями пространственной сетки полимера или стенками пор. Если размеры молекул соизмеримы со средним диаметром каналов в гранулах, то эти затруднения становятся весьма существенными и диффузия тормозится.
|
|
Может сложиться и такое положение, когда часть внутреннего объема гранул, т. е. часть объема неподвижной фазы (а иногда и весь этот объем), оказывается недоступной для молекул вещества, растворенного в подвижной фазе.
Различие степени доступности объема неподвижной фазы для молекул различных компонентов исходной смеси веществ является фактором, определяющим возможность их фракционирования. Очевидно, что оно будет происходить по размерам молекул (рис. 1). Если в составе смеси имеются очень крупные молекулы, вовсе не проникающие внутрь гранул, то они будут выходить из колонки или достигать края хроматографической пластины вместе с передним фронтом подвижной фазы («фронтом элюции»). В то же время мелкие молекулы, свободно диффундирующие внутрь гранул, часть времени будут находиться в неподвижной фазе. Статистически эта часть времени одинакова для всех молекул такого размера и зависит от соотношения объемов жидкости в неподвижной и подвижной фазах. Таким образом, все мелкие молекулы достигнут конца хроматографического пути более или менее одновременно и заведомо позднее, чем крупные. Молекулы промежуточных размеров, для которых из-за разброса значений эффективных диаметров пор внутри гранул неподвижной фазы доступна только часть ее объема, должны, очевидно, перемещаться вдоль колонки или пластины с промежуточной скоростью.
|
|
Рис. 1. Гель-фильтрационная хроматография. Малые молекулы в образце могут проникать внутрь гранул, вследствие этого они протекают через колонку медленнее. Крупные молекулы, которые не могут проникнуть в гранулы через поры, проходят сквозь колонку быстрее, чем более мелкие. Правильный размер пор и свойства растворителя являются решающими для хорошего разделения.
Это явление первоначально было названо «гель-фильтрацией», поскольку в качестве пространственной сетки использовали полимерные гели. Однако эти гели относительно легко деформируются и для хроматографии при высоком давлении непригодны, поэтому их стали заменять жесткими материалами, в частности пористым стеклом и силикагелем. Иногда для этого варианта хроматографии вводят термин «эксклюзивная хроматография» («exclusion» — исключение; имеется в виду исключение из гранул крупных молекул). Поскольку сейчас силикагель явно вытесняет пористое стекло, мы сохраним для рассматриваемого варианта хроматографии прежнее название — гель-фильтрация.
Очевидно, что размеры молекул связаны с их массами, но отнюдь не целиком ими определяются. Это особенно важно учитывать в случае макромолекул, размеры которых могут существенно зависеть от плотности упаковки полипептидной или полинуклеотидной цепи. В ограничении свободы диффузии через пространственную сетку пор внутри гранул немалую роль может играть и форма молекулы. Очевидно, что сферическая глобула будет диффундировать иначе, чем молекула такого же объема, но вытянутая в виде палочки.
Как во всех хроматографических разделениях излишняя длина колонки приводит к размыванию пика (Рис. 2).
Рис. 2. Уширение полос в колонке из-за чрезмерной длины колонки. Так называемая эффективная часть колонки является достаточной для разделения. Слишком длинные колонки не улучшают очистку, но вызывают разбавление образца из-за уширения полос.
Гель-фильтрационная хроматография является методом для оценки молекулярной массы молекул. Гель-фильтрация также оказывается полезной для измерения равновесий мономер-мультимер при микромолярных (мкМ) концентрациях биомолекул (Рис. 3).
Рис.3. Молекулы с известной молекулярной массой дают возможность оценить молекулярную массу неизвестной молекулы. В данном случае для исследуемой молекулы наблюдаются два пика, что указывает на равновесие мономер-димер.
Пористые материалы для гель-фильтрации чаще всего выпускаются в виде сферических гранул целого набора диаметров с различными средними размерами пор.
Гели на основе декстрана (сефадексы)
Декстран также представляет собой полисахарид — в основном линейный полимер на основе глюкозы, где звенья связаны β-1,6-глюкозидной связью
Рис.2. Химическая форма декстрана.
Это тоже полиатомный спирт с высокой степенью гидрофильности, предоставляющий столь же широкие, как и целлюлоза, возможности для модификации и также химически инертный. Устойчивость к действию кислот у декстрана еще меньше, чем у целлюлозы. Его не следует обрабатывать более крепким раствором, чем 0,1 н. НС1 (в течение 2 ч). К щелочи гели на основе декстрана более устойчивы: они сохраняют свои свойства в 0,25 н. NaOH до 2 мес даже при температуре 60оС. Рабочий диапазон рН составляет 2-12. Существенное отличие от целлюлозы состоит в том, что нити декстрина не образуют агрегатов, так как они не вполне линейны — имеются достаточно многочисленные ветвления (по связям 1.2-, 1,3- и 1,4-).
Химическая форма сефадекса.
В гелях для хроматографии («сефадексах») нити декстрана химически сшиты эпихлоргидрином. Однако сшивка не очень жесткая: сефадексы относительно мягки и легко сжимаются, а в водных растворах сильно набухают. Утери качества выражены тем сильнее, чем меньше процентное содержание эпихлоргидрина. Изменяя долю сшивки, можно регулировать средний размер пор, образуемых пространственной сеткой сшитого геля. Ввиду статистического распределения сшивок по объему геля разброс размеров пор невелик, и сефадексы заметно более гомогенны, а свойства их лучше воспроизводимы, чем у целлюлозы.
Они «не боятся» высушивания и при замачивании не требуют никакой специальной обработки. Сефадексы можно автоклавировать как в сухом, так и во влажном виде в нейтральной среде при 120оС в течение 30 мин. Суспензию сефадекса (набитую колонку) следует хранить с антисептиком, так как он, подобно целлюлозэ, легко атакуется микроорганизмами. Сефадексам присуща некоторая адсорбционная способность по отношению к ароматическим и гетероциклическим молекулам, которую даже удается использовать для фракционирования нуклеиновых оснований,ароматических аминокислот и пептидов. Кроме того, продажные сефадексы содержат в своей структуре небольшое количество карбоксильных групп, что придает им некоторое сродство к катионам. При хроматографии его легко подавить введением в элюент соли (NaCl) в концентрации около 0,02 М.
Мягкость сефадексов (особенно слабосшитых) накладывает ограничения на допустимые значения скоростей хроматографическон элюцпи, которые подробно рассмотрены ниже. По этой же причине определенные сложности возникают при использовании ионообмеиников па основе сефадексов: за счет сил электростатического отталкивания своих ионогенных групп они склонны деформироваться при изменении ионной силы элюента. Все это привело к разработке в последние годы ряда более жестких матриц, вытесняющих сефадексы из традиционных областей их применения — гель-фильтрации и ионообменной хроматографии.
Агароза
Как и предыдущие матрицы, агароза является полисахаридом, т. е. полиатомным спиртом. Ее элементарным звеном служит дисахарид агаробиоза. в состав которого входит необычный сахар - 3.6-ангидро-L-галактоза. Из-за этого агароза более устойчива к действию микроорганизмов, чем целлюлоза и сефадексы, однако ее тоже следует хранить в присутствии антисептика. Агароза очень гидрофильна, а ее полимерные нити еще в большей степени, чем нити целлюлозы, склонны к образованию водородных связей. Благодаря этому горячий 2-6%-ньтй раствор агарозы застывает в виде жесткого и очень крупнопористого геля. Нити полимера собираются в пучки и образуют жесткий пространственный каркас с пустотами внутри. При температуре около 100°С гель агарозы плавится, поэтому его нельзя автоклавировать: в случае необходимости гель приходится стерилизовать раствором диэтилпирокарбоната. Модификация агарозы может происходить также по гидроксильным группам, плотность расположения которых, однако, значительно ниже, чем у сефадексов, поскольку на звено дисахарида их приходится четыре вместо шести.
Положение усугубляется тем, что внутри плотно упакованных пучков нитей гидроксильные группы недоступны для модификации. В условиях хроматографии агароза химически неактивна, но уязвима для действия кислот, щелочей и окислителей. Рабочий диапазон рН при использовании матриц из обычной агарозы лежит в пределах 4-9. Агароза выдерживает непродолжительный контакт с 8 М мочевиной и 6 М гуанидиихлоридом, которые все же постепенно ее разрушают.Поскольку агароза для хроматографии представляет собой водный гель, о набухании ее говорить не приходится. Но следует помнить о том, что агарозу нельзя сушить ввиду необратимой деструкции геля. Агароза для хроматографии поставляется в виде суспендированных в воде сферических гранул диаметром 60— 200 мкм, которые в таком виде и следует хранить. При кратковременном обсыхании колонки, заполненной агарозой, пока гранулы не начали терять находящуюся в них жидкость, хроматографнческне характеристики сорбента еще могут быть восстановлены. Если же подсыхание гранул началось, то гель приходится выбрасывать (разумеется, его можно расплавить и использовать, например, для электрофореза, но гранулированная структура будет уже утрачена). Размер пор (пустот) в гранулах зависит от процентного содержания агарозьг в геле (2, 4 или 6%). Связанные с агарозой остатки сульфокислоты (до 0,5% по массе) могут сорбировать щелочные белки. Эта сорбция подавляется в присутствии 0,02 М NaCl или другой соли. Гранулированную агарозу для гель-фильтрации и синтеза аффинных сорбентов выпускают следующие фирмы: «Pharmacia» — под торговым названием «Sepharose», «Bio-Rad» — под названием «Bio-Gel A», «LKB» (Швеция) и «IBF» (Франция) — под названием «Ultrogel А».
Для повышения химической и термической стойкости матриц фирма «Pharmacia» разработала вариант гелей агарозы, в которых нити полимера дополнительно химически «сшиты» обработкой 2,3-дибромпропанолом в сильно щелочной среде. Матрицы на основе такой «сшитой» агарозы носят общее наименование «Sepharose CL». Их можно использовать в значительно более широком диапазоне рН (3—14) и даже автоклавировать при температуре 120оС. Они обладают еще большей жесткостью, выдерживают длительный контакт с 8 М мочевиной и 6 М гуанидинхлоридом, а также со многими органическими растворителями (этанолом, ацетоном, хлороформом, пиридином, ацетонитрилом, дихлорэтаном, ДМФ, ДМСО и др.). Последнее обстоятельство имеет важное значение для осуществления реакций модификации.
В настоящее время агароза широко применяется как в колоночной хроматографии в виде модифицированных сорбентов состоящих из сферических гранул строго определенного размера (Q-Sepharose, SP-Sepharose, Phenyl-Sepharose и т.д.), так и в виде гелей, в основном применяемых для электрофоретического разделения нуклеиновых кислот при молекулярно-биологических и биотехнологических исследованиях.
Полиакриламидный гель
Нити линейного полимера акриламида, сшитые N.N'-метиленбисакриламидом, образуют относительно жесткую и химически инертную пространственную сетку геля, хорошо удерживающую воду. Пористость и жесткость геля определяется процентным содержанием в нем полимера. Гранулированные матрицы полиакриламидного геля (ПААГ) используются только для гель-фильтрации. Рабочий диапазон рН — 3-8. Гель можно автоклавировать; он выдерживает контакт с разбавленными органическими кислотами, 8 М мочевиной, 6 М гуанпдинхлоридом, детергентами. В отличие от агарозы ПААГ «не боится» высушивания. Матрицы поставляются и виде сухих сферических гранул нескольких диапазонов диаметров в интервале от 40 до 300 мкм. При замачивании они сильно набухают и могут связывать, в зависимости от содержания ПААГ, от 3 до 30 мл воды на 1 г сухих гранул.
Полиакриламидпые патрицы выпускают фирмы «Bio-Rad» (под общим названием «Bio-Gel P») и «Roanal» (под названием «Акрилекс»). На основе полиакриловой кислоты выпускают также ионообменники — «Trisacryl» (фирма «LKI3») и «Bio-Rex 70» (фирма «Bio-Rad»).
В целях объединения достоинств описанных выше материалов было создано два новых типа комбинированных матриц — «Sephacryl» и «Ultrogel AcA».
Сефакрилы
Структура полиэтиленбисакриламида.
Торговое название «Sephacryl» получила разработанная фирмой «Pharmacia» матрица для гель-фильтрации на основе декстрана и N,N'-метиленбисакриламида. В ней удачно сочетаются качества сефадексов и ПААГ — нити декстрана и полимерные нити метилеп-бисакриламида (он способен полимеризоваться в нити подобно акрил-амиду химически связаны друг с другом).
Получается очень жесткий гель, пористость которого легко контролировать. Он гидрофилен, химически инертен, выдерживает контакт с 8 М мочевиной, 6 М гуанидинхлоридом, детергентами и органическими растворителями; его можно автоклавировать при 120oС. Рабочий диапазон рН — 2-11. Благодаря своей жесткости сефакрил может быть использован при значительно больших скоростях элюции, чем сефадекс с такой же пористостью. Адсорбция здесь несколько более заметна, чем у сефадексов, особенно при кислых значениях рН (ее подавляет 0,05 М NaCl). Сефакрил поставляется в виде суспензии набухших гранул с размерами 40—105 мкм.
Ультрагели типа АсА
«Ultrogel AcA» — еще один вариант жесткой матрицы, обеспечивающей широкие возможности выбора размера пор. Здесь контролируемая пористость ПААГ сочетается с жесткостью агарозы — сетка ПААГ полимеризуется внутри жесткого каркаса агарозы. Химической связи между ними нет, но агароза придает жесткость сферическим гранулам ультрогеля, в то время как их пористость определяет ПААГ. По химической и термической стойкости эта матрица сходна с агарозой; диапазон диаметров гранул — 60—140 мкм. Матрицы типа «Ultrogel AcA» с различным содержанием агарозы и ПААГ в виде водных суспензий поставляют фирмы «LKB» и «113F». Эти матрицы нашли применение не только для гель-фильтрации, но и для синтеза аффинных сорбентов на их основе.
Полистирольные смолы
Нити линейного полимера полистирола, химически «сшитые» молекулами дивинилбензола в жесткую пространственную сетку, выпускаются в виде сухих сферических гранул под торговым названием «смол» («resins»).
Структура полистирола
Содержание дивинилбензола варьирует от 2 до 12%, определяя средние размеры пор сетки. Эти размеры обычно малы, так что внутренний объем гранул полистирола доступен только для низкомолекулярных соединений (нуклеотидов, аминокислот, коротких пептидов и др.). Впрочем, имеются и «макроретикулярные» типы смол на основе полистирола; при их изготовлении микрогранулы смолы спекаются в гранулы обычных размеров (30—300 мкм). Внутренний объем таких гранул, представленный свободным пространством, остающимся между микрогранулами, доступен для биологических макромолекул.
Немодифицированные полистирольные смолы гидрофобны. Модификация осуществляется присоединением ионогенных групп по остаткам бензола в пара-положении. Это придает смоле в целом гидрофильность, хотя возможность и склонность к гидрофобным взаимодействиям с фракционируемым материалом сохраняется. Для хроматографии компонентов белков и нуклеиновых кислот в водных элюентах смолы на основе полистирола применяются только в качестве матриц ионообменников. Благодаря частоте расположения в пространстве остатков бензола эти матрицы отличаются высоким содержанием ионогенных групп. Химически они очень устойчивы (можно промывать 4 н. НС1 и 2 н, NaOH) и выдерживают нагревание до 120°C. При замачивании гранулы набухают, связывая (в зависимости от пористости) от 1 до 3 мл воды на 1 г сухой смолы. Макроретикулярные ионообменники на основе полистирола можно, вообще говоря, использовать для хроматографии белков, но при этом следует опасаться денатурации за счет гидрофобных взаимодействий белковых глобул с материалом матрицы.
Для липофильных белков мембран такое взаимодействие, по-видимому, опасности не представляет.
Наиболее популярные ионообменники на основе полистирола выпускаются под торговыми названиями «Dowex» (фирма «Dow Chemical Со») и «Amberlyte» (фирма «Rohm and Haas») и перепродаются большинством фирм, торгующих биохимическими реактивами. Хороню промытые и отсеянные обменники тина «Dowex» для аналитических целей поставляет фирма «Bio-Rad» под наименованием «Bio-Rad AG». Повышенные требования, предъявляемые к ионообменникам для современных аминокислотных анализаторов, привели к разработке специальных полистирольных смол («Aminex», «Durrum» и др.) с малым разбросом размеров около номинальных значений порядка 10—20 мкм. Для высокоэффективной хроматографии при высоких давлениях (ЖХВД) производят так называемые «пленочные ионообменники, у которых пленка полистпрольной смолы толщиной около 1 мкм фиксирована на поверхности стеклянных шариков диаметром 4 мкм («Whatman-Pellionex»).
Пористое стекло
Путем специальной обработки щелочно-боросиликатного стекла и последующей экстракции растворимого материала удается получить стеклянные шарики с хорошо контролируемым размером пор — типа CPG-10 («controlled pore glass»). В качестве матриц для гель-фильтрации они привлекательны своей жесткостью, химической инертностью и жаростойкостью (при стерилизации). Однако следует иметь в виду, что их поверхность несет небольшой отрицательный заряд и может сорбировать, а иногда и денатурировать белки. Пористое стекло, ассортимент которого включает 11 размеров пор (от 75 до 3000 А) и два, три или четыре диапазона диаметров шариков (от 20 до 400 МЕТИ), поставляется фирмами «BDH» («Glass granules CPG-10»), «Serva» («CPG-10») и «Sigma» («PG»). Последние две фирмы производят также пористое стекло, у которого поверхностный заряд блокирован химической присадкой глицеридов: «CPG-10 Polyol» («Serva») и «GG» («Glyceryl glass»; «Sigma»).
ПРИНЦИП ГЕЛЬ-ФИЛЬТРАЦИИ (подробно в картинках)
На колонку, упакованную сорбентом, наносят раствор образца.
Важно: лимитирующим является объем раствора образца; для аналитических разделений он не должен превышать 0,1% отCV (общего объема колонки), а для препаративной очистки он должен быть не выше 8-10% от CV; в противном случае разделения сложно будет достичь!
Раствор образца, допустим, содержит три типа веществ: высокомолекулярные, среднего размера и низкомолекулярные.
Высокомолекулярные не могут поместиться в поры сорбента, поэтому их объем удержания равен свободному объему колонки. Они элюируются первыми.
Средние частицы помещаются в поры сорбента, но не полностью. Поэтому их объем удержания немного выше свободного объема. Они элюируется вторыми.
Маленькие вещества долго путешествуют внутри пор сорбента, могут там заблудиться и найтись не скоро. Их объем удержания намного выше свободного (чаще всего их объем удержания приближается к общему объему колонки, т.е. 100% CV). Они вымываются последними.
МАТРИЦЫ ДЛЯ Гель-Фильтрации
Гель – гетерогенная система, в которой подвижная фаза (обычно водная) всегда находится внутри пор неподвижной фазы, называется гелевой матрицей
Матрицы:
- Низкого давления
- Высокого давления
ОСНОВНЫЕ ОБЛАСТИ ПРИМЕНЕНИЯ.
- Очистка веществ, фракционирование по размеру
- Разделение мономеров, димеров и агрегатов более высокого порядка
- Обессоливание веществ и «перебуферирование»
- Анализ высокомолекулярных примесей
- Определение молекулярной массы аналита
Дата добавления: 2018-04-15; просмотров: 4255; Мы поможем в написании вашей работы! |
Мы поможем в написании ваших работ!