Биотехнология аминокислот. Микробиологический синтез. Продуценты. Преимущества микробиологического синтеза перед другими способами получения

Стр 1 из 3Следующая ⇒

Питательные среды в микробиологическом производстве. Классификация по составу. Сырье. Методы стерилизации. Сохранение биологической полноценности сред при их стерилизации.

Питательная среда перед засевом каким-либо биообъектом также должна быть стерильной. В таких случаях прибегают к тепловой стерилизации, заботясь при этом о сохранении стабильности ингредиентов среды. В микробной биотехнологии обычно используют методы периодической и непрерывной стерилизации. Первую из них осуществляют в аппаратах малой емкости непосредственно в ферментаторах глухим или острым паром под давлением в течение 30-40 мин, при температуре порядка 134°С (2,02650 х 10⁵ Па) после удаления воздуха из аппарата при нагреве до 100°С. Затем среду охлаждают водой через змеевик или рубашку аппарата и засевают тем или иным биообъектом. Метод непрерывной стерилизации основан на том, что концентрат питательной среды подают насосом через систему конструкций, включающую нагреватель, выдерживатель (собственно стерилизатор) и теплообменник (охладитель, в котором охлаждение среды происходит до температуры, оптимальной для культивирования клеток).

В лабораторных условиях стерилизацию питательных сред и некоторых других объектов осуществляют в автоклавах. Стерилизацию проводят паром под давлением, соблюдая необходимые режимы. В отдельных случаях прибегают к сухожаровой стерилизации.

Изучение технологии получения питательных сред

В промышленности микробного синтеза широко используются чистые углеводы, а также природные и технические продукты, богатые углеводами, К ним относятся глюкоза, сахароза, лактоза, крахмал, кукурузная мука, меласса, зеленая патока.

Для приготовления питательных сред используются техническая глюкоза. Она содержит не менее 99,5% редуцирующих веществ (в пересчете на сухой остаток) и фактически представляет собой чистый углевод.

Сахароза - свекловичный иди тростниковый сахар. Техническая сахароза, используемая в промышленности, содержит не менее 99,75% сахарозы, которая представляет собой дисахарид, состоящий из глюкозы и фруктозы.

Лактоза - молочный сахар. Она содержится только в молоке и в других природных продуктах не обнаружена. Получают лактозу из молочной сыворотки, которая образуется при производстве сыров, творогов, казеина. Лактоза представляет собой дисахарид состоящий из глюкозы и галактозы.

Крахмал - на 96-97% состоит из полисахаридов, кроме того, в нем присутствуют минеральные вещества и жирные кислоты. Полисахариды крахмала представлены двумя типами - амилазой (10-20%) и амилопектином (80-90%).

Крахмал получают из картофеля или кукурузы. Крахмалы разного происхождения значительно различаются по разветвленности цепей, степени полимеризации и некоторым другим свойствам. Под действием амилолитических ферментов крахмал расщепляется до глюкозы, которая в дальнейшем утилизируется продуцентом по гликолитическому или пентозофосфатному путям.

Кукурузную муку получают при разматывании зерен кукурузы. В промышленных средах кукурузная мука часто заменяет крахмал, являясь более дешевым сырьем. Кукурузная мука содержит:

крахмал - 67-70%;

другие углеводы (клетчатка, пептозаны, растворимые углеводы) - 10%;

белки - 12%;

зола --0,9%.

Среди зольных элементов в небольшом количестве присутствуют ионы фосфора, калия, магния. Состав кукурузной муки может колебаться в значительных пределах в зависимости от сорта кукурузы, условий ее выращивания и хранения.

Меласса - отход сахарного производства. Она представляет собой маточный раствор, образующийся при отделении кристаллов сахарозы на центрифуге после третьей кристаллизации. По внешнему виду меласса - густая вязкая жидкость темно-коричневого цвета. Состав непостоянен и может колебаться в зависимости от почвенных и климатических условий выращивания свеклы, технологии ее переработки, условий транспортировки и хранении мелассы.

Нормальная меласса в среднем содержит: сухие вещества - 75-82%, сахароза - 45-50%, общий азот - 1,2-2,2%, зола 6-10%. В мелассной золе присутствует много калия, магния, кальция, железа, но сравнительно мало фосфора. Кроме того в мелассе содержится ряд аминокислот, витаминов группы В и органических кислот.

Зеленая патока - отход производства глюкозы их крахмала. Она содержит не менее 76% редуцирующих веществ, золы - не более 3,5%, сухих веществ - не менее 50%. Сахара зеленой патоки состоят в основном из глюкозы. Основная часть зольных элементов - хлористый натрий, образующийся при нейтрализации соляной кислоты, применяемой для гидролиза крахмала содой.

Азотное питание микроорганизмов по своему значению приближается к углеродному, хотя уступает последнему по объему. Азот входит в состав клеточных компонентов, которые обеспечивают жизнеспособность организмов. Источниками азотного питания для продуцентов БАВ служат различные азотсодержащие вещества неорганического и органического происхождения. Источниками минерального азота чаще всего являются соли аммония и азотной кислоты. В качестве органических источников азота в промышленности наиболее широко применяются кукурузный экстракт и соевая мука.

Кукурузный экстракт - это отход производства крахмала из кукурузы. По внешнему виду это густая жидкость темно-коричневого цвета с хлопьевидной взвесью или почти однородная. В состав кукурузного экстракта входят:

азот общий - 6-8%;

азот аминный - 1-3%;

азот белковый - 0,8-2%;

углеводы - 0-10%;

органические кислоты - 15-20%;

зола - не более 24%.

Основными элементами золы являются фосфор, калий, магний. Кукурузный экстракт также содержит витамины группы. В некоторые ростовые вещества, биостимуляторы.

Соевую муку получают при размалывании соевых бобов, а также соевого жмыха и шрота, образующихся после извлечения соевого масла. Соевая мука подразделяется на необезжиренную, полуобезжиренную и обезжиренную. Кроме того, соевая мука бывает дезодорированная (обработанная паром) и недезодорированная. Обработка паром позволяет увеличить срок хранения, и дезодорированная мука может храниться в течение года, а недезодорированная - 1,5 - 3 месяца.

Из основных компонентов соевой муки особое значение для процессов ферментации имеют азотсодержащие вещества. Азот соевой муки находится главным образом в составе белков, на долю которых приходится 40,5%. Кроме белков в соевой муке содержатся углеводы - до 25%; органические кислоты - 1,5%; зола 4,5-6,5%. В необезжиренной муке присутствует 19,5% жира. В состав золы входят ионы калия, фосфора, магния, кальция, а также ряд микроэлементов.

Минеральные компоненты играют важную роль в жизнедеятельности микроорганизмов. Содержание их в клетке относительно не велико, но функции чрезвычайно важны. Минеральные элементы в клетках микроорганизмов необходимы для регулирования осмотического давления, окислительно-восстановительных условий и величины рН. Они изменяют гидрофильность протоплазмы, а также играют и пластическую роль, входя в состав конструктивного материала клеток.

Минеральные элементы участвуют в формировании пространственной структуры биополимеров - белков и нуклеиновых кислот.

Одна из основных функций минеральных элементов - участие в ферментативном катализе. В настоящее время действие четвертой части всех ферментов в клетки связано с металлами. Минеральных состав питательной среды формирует распределение электрических зарядов на поверхности клетки. Обычно клетки микроорганизмов имеют отрицательных заряд. При добавлении в среду электролитов он снижается и тем сильнее, чем выше валентность добавляемого противоиона. Изменение электрического потенциала клеток может изменить их физиологическую деятельность, воздействовать на селективность клеточной мембраны, вызвать флокуляцию или флотацию клеток.

Питательные среды по своему составу подразделяются на две группы: натуральные (естественные) и синтетические.

Натуральными называются среды, имеющие неопределенный химический состав, так как в них входят продукты растительного или животного происхождения, отходы различных производств. На натуральных средах хорошо развиваются многие микроорганизмы, так как в этих средах имеются, как правило, все компоненты, необходимые для их роста и развития.

Синтетическими называются среды, в состав которых входят только определенные химически чистые соединения, взятые в точно указанных концентрациях. Такие среды широко используются для исследований, связанных с изучением обмена веществ микроорганизмов.

По физическому состоянию среды подразделяются на жидкие, плотные и сыпучие.

Жидкие среды используются для накопления биомассы или продуктов метаболизма. Плотные среды готовят из жидких, добавляя агар-агар или кремнекислый гель (силикагель). Агар-агар удобен тем, что большинство микроорганизмов не может использовать его в качестве субстрата и поэтому он является лишь уплотняющим средством. В холодной воде полисахарид нерастворим, но растворяется в ней при нагревании до высокой температуры (90-100° С). При охлаждении агаровая среда застывает в виде студня с гладкой поверхностью. Такие среды используются' для выделения чистых культур, для хранения культур, количественного учета микроорганизмов и в ряде других случаев.

Сыпучие среды - разваренное пшено, перловая крупа, Отруби, пропитанные питательным раствором - используют в промышленной микробиологии для получения некоторых БАВ, например, ферментов.

Биотехнология аминокислот. Микробиологический синтез. Продуценты. Преимущества микробиологического синтеза перед другими способами получения.

Аминокислоты являются составными элементами белков. Все 20 аминокислот являются мономерами для построения природных полипептидов и хорошо изучены (методы их синтеза давно подробно описаны). Известно также, что эти соединения существуют в виде оптических изомеров (вспомните теорию строения органических соединений Бутлерова A.M., открывшего ассиметрию атома углерода с четырьмя заместителями, определяющими направление и степень вращения плоскости поляризованного света) .

Современные методы органического синтеза позволяют синтезировать L- и D-формы аминокислот, но только как рацематы, дальнейшее разделение которых представляет трудную задачу и экономически не эффективно.

Другой способ получения аминокислот - это микробиологический синтез, когда используют штаммы-продуценты, осуществляющие сверхсинтез аминокислот. Избыточные количества аминокислот, например, L -лизина, L -глутаминовой кислоты, L -треонина, L -трептофана экскретируются (выходят) в культуральную (внешнюю) среду. Культуральная среда в этом случае может содержать от четырех, пяти и до ста граммов целевой аминокислоты на один литр жидкой фазы. В отличие от химического синтеза, в этом случае, то есть при биосинтезе аминокислот с помощью ферментных систем микроорганизмов, получаются исключительно L-формы аминокислот, обуславливающих терапевтический эффект, а не рацематы. Это обстоятельство решает проблему

выбора получения аминокислот в промышленном масштабе в пользу биотехнологических методов.

Аналогичная ситуация сложилась и в области производства антибиотиков. Химический синтез, как правило, не эффективен. Именно поэтому в фармацевтической промышленности антибиотики получают с помощью штаммов-продуцентов, которые генерируют нужный антибиотик в определенной фазе роста в заданном режиме культивирования. Однако, использование в дальнейшем химической трансформации природных антибиотиков рождает новые лекарственные средства и помогает преодолевать резистентность микроорганизмов к лекарственным препаратам, повышая эффективность лечения.

Сегодня известны 4 метода получения аминокислот:

1. химический метод (тонкий органический синтез)

2. химико-энзиматический метод (энзиматическая трансформация химически
синтезированных предшественников аминокислот с образованием
биологически активных L-изомеров). Метод достаточно дорогой.

3. биологический метод ( применение гидролиза белоксодержащих
субстратов)

4. прямой микробиологический метод (получение L-аминокислот). Метод
более дешевый, экономически выгодный.

Наиболее распространенными методами получения аминокислот являются химико-энзиматический и микробиологический.

В качестве примеров использования химико-энзиматического метода можно привести:

• синтез аспарагиновой кислоты из фумаровой (используются клетки
Escherichia coli)

• синтез L-фенилаланина из коричной кислоты (используются клетки
дрожжей).

Имея задачу получения аминокислот, используя природные микроорганизмы, надо помнить о механизмах регуляции биосинтеза по принципу обратной связи (ретроингибирование). Эта регуляция осуществляется либо за счет ингибирования активности одного из начальных ферментов собственного синтеза избыточным продуктом, то есть самой аминокислотой, либо репрессируется весь комплекс ферментов всей биохимической цепочки метаболизма клетки, что является естественной реакцией живого микроорганизма-продуцента для сохранения собственного равновесия на клеточном уровне. Таким образом перед биотехнологом стоит задача в нарушении этих механизмов, чтобы иметь возможность получить целевой продукт в необходимых количествах.

Как это делается, можно рассмотреть на примере продуцентов лизина (Corynebacterium glutaminicum) и треонина (Escherichia coli).

У Corynebacterium glutaminicum есть принцип согласованного ингибирования ферментативной активности, что является особенностью биосинтеза биосинтеза предшественника лизина. Ингибирование синтеза лизина в клетке возможно только при повышенной концентрации обеих конечных продуктов -лизина и треонина. Самостоятельно ни лизин, ни треонин не ингибируют активности ключевого фермента -аспартакиназы. Они ингибируют этот синтез только вместе. Таким образом, вызвать сверхсинтез лизина можно лишь нарушив синтез треонина или его предшественника - гомосерина.

Действительно, большинство продуцентов лизина не способны синтезировать гомосерин или треонин, то есть являются «ауксотрофами» по этим аминокислотам.

Таким образом большинство продуцентов лизина нуждается в присутствии гомосерина или треонина, иначе они работать не будут. Зная это, биотехнолог, выращивая такие продуценты, должен обязательно вносить в питательную среду от половины грамма и до полутора граммов на один литр гомосерина или треонина. В этом случае происходит активный рост биомассы продуцента без синтеза лизина. Как только треонин исчезает из среды и рост биомассы прекращается, начинается активный синтез лизина. Таким образом, данный процесс имеет две стадии развития

1. рост биомассы

2. синтез лизина

Продолжительность синтеза составляет 2-3 суток. Уровень накопления продукта составляет 50-100 граммов на литр. Это особенности биосинтеза лизина.

Второй пример. Минтез треонина. Особенности регуляции биосинтеза треонина в клетках Escherichia coli (кишечной палочки). В этом случае ситуация другая. У кишечной палочки нет механизма согласованного ингибирования ферментативной активности, то есть, если лизин ингибирует активность своих ферментов по принципу обратной связи, то треонин - своих ферментов. Кроме того, имеет место «репрессия» всего комплекса треониновых ферментов при избытке треонина или изолейцина и это похоже на «согласованную репрессию» Самостоятельно (по отдельности) ни треонин, ни изолейцин не репрессируют синтез ферментов.

Для решения задачи получения треонина в необходимых количествах пришлось сделать следующее:

1. изменить, сделать нечувствительным к треонину первый фермент треонина

2. снизить активность фермента, синтезирующего из треонина изолейцин

3. убрать механизм репрессии при недостаточном количестве изолейцина несмотря на избыток треонина

4. применить генную инженерию (выделить треониновые гены и размножить их на плазмидах в клетке микроорганизма, резко повысив синтез треонина клетками продуцента)

В рассматриваемом случае синтез треонина отличается от синтеза лизина тем, что его синтез происходит одновременно с ростом биомассы. Здесь уже нет двух стадий.

Особенности культивирования штаммов-продуцентов аминокислот приводят к следующему результату:

1. достигаются максимально высокие скорости синтеза аминокислот
клетками продуцента

2. достигается максимальная длительность работы продуцента

3. минимально образуются побочные продукты биосинтеза аминокислот.
Первая задача решается путем выращивания высокоактивной биомассы и помогают в этом случае наличие в питательной среде: источников углерода, аммонийного азота, минеральных солей, ростовых факторов; оптимизация рН (кислотность среды) температуры; дробная подача субстратов.

Для предотвращения закисления среды проводят автоматическое рН-статирвоание аммиачной водой и источниками углерода.

В случае биосинтеза лизина добавляют ростовые факторы по мере необходимости, что зависит от самого сырья, от аппаратуры, от температуры. Процесс биосинтеза энергоемкий и требует интенсивной аэрации и перемешивания.

Для длительной работы ауксотрофных продуцентов лизина в питательную среду вносят комплексный источник аминокислот (белковые гидролизаты).

Внимание! Синтез нужной аминокислоты может прекращаться, если на ее продуцент действуют его токсические метаболиты, которые синтезируются самим продуцентом. Например, в процессе биосинтеза фенилаланина, продуцентом которого является Bacillus subtilis, этот продуцент синтезирует примеси ацетоина и бутандиола, в результате этого клетки продуцента лизируются, образуют споры и прекращают вырабатывать фенилаланин. Чтобы избежать это явление, необходимо ферментацию вести в условиях лимита (ограничения) по источнику углерода. В этом случае весь сахар расходуется только на синтез фенилаланина, увеличивая как количество (в два раза), так и чистоту получаемого продукта.

В заключение можно сказать, что:

- эффективность использования субстрата при биосинтезе аминокислот зависит от продуктивности биомассы,

- если синтез аминокислот разобщен с ростом биомассы ( смотри лизин), то эффективность использования субстрата будет тем выше, чем дольше будет работать культура после остановки роста,

- если же синтез аминокислоты идет параллельно росту биомассы (смотри треонин), то эффективность биомассы можно увеличить добавляя определенное количество предшественников.

Наиболее перспективным направлением являются методы генетической инженерии - введение в клетку продуцента многокопийных плазмид, содержащих гены, контролирующие биосинтез аминокислот в ущерб синтезу биомассы и других клеточных компонентов.

С помощью гибридных плазмид в биосинтезе аминокислот мы получаем

1. рост продуктивности биомассы

2. исчезновение примесей (более чистый продукт)

3. возрастает коэффициент использования субстрата (его минимум дает максимум продукта).

Дата добавления: 2018-04-04; просмотров: 6437; Мы поможем в написании вашей работы!

Поделиться с друзьями:

12 3 Следующая ⇒

Мы поможем в написании ваших работ!