Биотехнологическое производство рекомбинантного инсулина. Экономические аспекты. Создание рекомбинантных белков «второго поколения» на примере инсулина
Nbsp;
Биообъекты как средства производства лекарственных, профилактических и диагностических средств. Классификация. Характеристика. Основные группы получаемых биологически активных веществ.
Центральным и обязательным элементом биотехнологического производства, создающим его специфику, является биообъект.
Биообъектом может быть целостный сохранивший жизнеспособность многоклеточный или одноклеточный организм. Им могут являться изолированные клетки многоклеточного организма, а также вирусы и выделенные из клеток мультиферментные комплексы, включенные в определенный метаболический процесс. Наконец, биообъектом может быть индивидуальный изолированный фермент.
Функция биообъекта – полный биосинтез целевого продукта, включающий обычно ряд последовательных ферментативных реакций или катализ лишь одной ферментативной реакции, которая имеет ключевое значение для получения целевого продукта. Биообъект, осуществляющий полный биосинтез целевого продукта называется продуцентом. Биообъект, являющийся индивидуальным ферментом или выполняющий функцию одной ферментативной реакции используемой биотехнологом – именуют промышленным биокатализатором.
Таким образом, к биообъектам относятся как макромолекулы, так микро- и макроорганизмы. В качестве макромолекул в промышленном производстве используются все известные классы ферментов, но наиболее часто - гидролазы и трансферазы. Доказано, что использование ферментов в производстве в иммобилизованном виде, то есть связанных с нерастворимым носителем, является наиболее рациональным, так как в этом случае обеспечивается многократность их применения и стандартность
|
|
|
повторяющихся производственных циклов.
В любом технологическом процессе в биотехнологии используют биообъекты (источники сырья или биохимических каталитических процессов).
Биообъект – автономная саморегулирующаяся система.
Виды биообъектов:
- макроорганизмы из животного и растительного мира.
- грибы.
- бактерии.
- вирусы.
- культуры клеток эукариот.
- информационные макромолекулы (ДНК или РНК).
- функциональные макромолекулы (ферменты, биокатализаторы).
- человек (донор того или иного полупродукта).
Выращивание клеток высших растений возможно в виде:
- каллуса – нароста недифференцируемой меристемы на поверхности питательной среды.
- в виде суспензии в жидких средах.
Выращивание клеток высших животных возможно:
- на твердых носителях.
- в виде суспензии в жидких средах.
Преимущества использования биомасс и каллуса:
- возможность получения сырья с заданными характеристиками (стандартизация).
|
|
|
- повышение выхода полу- и конечного продукта.
- сокращение сроков культивирования.
- возможность промышленного получения редких растений и биоматериалов (раувольфия, диаскорея, унгерния).
Все биообъекты (микрообъекты) относятся либо к прокариотам (сине-зеленые водоросли, бактерии, вирусы, бактериофаги), либо к эукариотам (простейшие, водоросли, грибы).
Способы использования биомассы:
- получение биомассы с последующим её использованием в качестве полупродукта или искомого ЛП.
- использование продуктов жизнедеятельности биообъектов (производство аминокислот, антибиотиков, полисахаридов, витаминов).
- использование биообъекта для биотрансформации веществ (витамин С).
- иммобилизация биообъектов.
Преимущества иммобилизации:
- повышенная стабильность и устойчивость к воздействиям окружающей среды.
- возможность создания непрерывных или полунепрерывных технологических потоков.
- снижение затрат на выделение и очистку продуктов реакции.
В природе существует огромное число микроорганизмов, которые способны синтезировать продукты или осуществлять реакции, которые могут быть полезны для биотехнологии. Однако практическое применение нашли не более 100 видов микроорганизмов (бактерии, грибы, дрожжи, вирусы, водоросли).
|
|
|
Дрожжи широко используют в хлебопечении, пивоварении, виноделии, получении соков, кормового белка, питательных сред для выращивания бактерий и культур животных клеток. Из 500 известных видов дрожжей используется только несколько видов – Saccharomyces cerevisiae, Saccharamyces carlsbergencis, Saccharomyces uwarum.
Среди бактерий чаще всего применяют в биотехнологии представителей следующих родов: Acetobacter, которые превращают этанол в уксусную кислоту и уксусную кислоту в углекислый газ и воду; Bacillus – для получения ферментов (B. subtilis), средств защиты растений (В. thuringiensis); Clostridium – для сбраживания сахаров в ацетон, этанол, бутанол; псевдомонады – например, P. Denitrificans – для получения витамина В12, Corynebacterium glutamatum – для получения аминокислот и др.
Для получения разнообразных антибиотиков в биотехнологии применяют актиномицеты (род Streptomyces), грибы рода Penicillium и др.
Многие микроорганизмы – бактерии, дрожжи, вирусы – используются в качестве реципиентов чужеродного генетического материала с целью получения рекомбинантных штаммов–продуцентов биотехнологической продукции. Получены рекомбинантные штаммы E. coli, продуцирующие интерфероны, инсулин, гормон роста, антигены вируса СПИДа; штаммы B. subtilis, вырабатывающие интерферон; штаммы дрожжей, продуцирующие интерлейкин–2, антиген вируса гепатита В; рекомбинантные вирусы осповакцины, синтезирующие антигены гепатита В, вируса бешенства, клещевого энцефалита и др.
|
|
|
Для получения вакцин и диагностических препаратов используют также патогенные микроорганизмы (брюшного тифа, коклюша, дифтерии, столбняка и др.).
Широкое применение в биотехнологии нашли культуры животных и растительных клеток. Известно, что строение, физиология и биотехнология животных и растительных клеток более сложные, чем у бактериальных клеток. Из культур животных и растительных клеток можно извлечь более широкий ассортимент продуктов сложной, цепной реакции, но процесс культивирования растительных и животных клеток более трудоемкий и дорогостоящий. Из культур тканей растений можно получать разнообразные соединения, используемые в медицине (алкалоиды, противовоспалительные вещества, противолейкозные и противоопухолевые, противобактериальные, сердечные и почечные средства, ферменты, витамины, опиаты и др.), сельском хозяйстве, химической и других отраслях промышленности. Животные клетки используют как для получения продукции, так и для выращивания в клетках вирусов с целью получения из них вакцин и диагностических препаратов.
Таким образом, в современном биотехнологическом производстве используют весьма широкий ассортимент биообъектов, классификация которых весьма сложна и наиболее рационально может быть выполнена на основе принципа их соразмерности. В таблице приведены биологические объекты, объединенные в 5 групп, причем, соразмерность в первых четырех имеет кратность в три порядка и только в пятой группе собраны биообъекты, отличающиеся по размерам от предшествующей (четвертой) группы всего на один порядок.
Биообъекты, используемые при биотехнологических способах производства лекарственных (диагностических, лечебных и профилактических) средств:
| 1. | Размер от 10 м до 1 см: человек, животные, растения-бионакопители сапонинов, алкалоидов и т.п. |
| 2. | Размер от 1 см до 1 мм: гигантские водоросли, каллусные культуры меристемы, культуры тканей, культуры клеток. |
| 3. | Размер от 1 мм до 1 мкм: клетки эукариот и прокариот в культуре, биопродуценты и биотрансформаторы. |
| 4. | Размер от 1 мкм до 1 нм: бактериофаги, вирусы, липосомы. |
| 5. | Размер менее 1 нм: ДНК, ферменты, макромолекулы-носители. |
Требования, предъявляемые к биообъектам для реализации биотехнологических процессов: чистота, высокая скорость размножения клеток и репродукции вирусных частиц, активность и стабильность биомолекул или биосистем.
Биотехнологическое производство рекомбинантного инсулина. Экономические аспекты. Создание рекомбинантных белков «второго поколения» на примере инсулина.
Биотехнология рекомбинантных белков охватывает производство:
• гормонов (инсулина)
• вакцин (против гепатита В0
• пептидных факторов роста тканей
• рекомбинантных интерферонов (они представляют неспецифическую
защиту клетки от вирусов и злокачественных образований)
На первом месте среди них по значению стоит рекомбинантный инсулин,
составляющий около 30% от всего рынка рекомбинантной продукции.
В проблеме производства рекомбинантных белков очень важно, чтобы
используемые в этом случае микроорганизмы, в которые вносят чужеродные
гены, удовлетворяли бы следующим свойствам:
1. Метаболизм микроорганизма должен быть хорошо изучен, поэтому в
качестве продуцентов рекомбинантных белков используют именно
такие микроорганизмы: это Escherichia coli, Bacillus subtilis,
Saccharomyces cerevisie.
2. Микроорганизмы должны быть не патогенны.
3. Микроорганизмы должны хорошо и интенсивно размножаться в
условиях ферментера.
4. Желательно, чтобы микроорганизм был способен выделять
секретируемый им чужеродный белок в среду. Это можно достичь, если
ввести в клетку реципиента ген, который синтезирует рекомбинантный
белок с дополнительной аминокислотной последовательностью,
состоящий из гидрофобных аминокислот. Роль гидрофобных
аминокислот состоит в том, что они перетаскивают белок в липидную
мембрану, в которой с помощью определенных ферментов (сигнальных
протеаз), гидрофобная последовательность отщепляется и образуется
нужный целевой продукт – это рекомбинантный белок, выходящий в
среду.5. Должна быть возможность сделать клетки микроорганизмов
компетентными для того, чтобы их клеточная стенка была бы
проницаема для плазмид.
Промышленное производство рекомбинантного инсулина
Инсулин, как вы знаете, является регулятором углеводного обмена. В
организме человека инсулин синтезируется в бетаклетках островков Лангерганса
поджелудочной железы. При отсутствии или недостатке его синтеза развивается
такое заболевание как сахарный диабет (инсулинозависимый диабет – 1 типа).
При сахарном диабете повышается содержание глюкозы в крови и развиваются
патологические процессы. Диабет II типа (инсулинозависимый) возникает при
дефектах в структуре рецепторов, отвечающих за проникновение глюкозы в
клетку. Все эти сведения касаются этиологии такого заболевания как сахарный
диабет.
Следующий вопрос, который надо рассмотреть, это структура инсулина.
Итак, инсулин это пептидный гормон, состоящий из двух пептидных цепей:
А-цепь состоит из 21 аминокислотных остатков.
В-цепь состоит из 30 аминокислотных остатков
Эти две цепи связаны бисульфидными SS связями, которые обеспечивают
пространственную структуру белка инсулина.
При синтезе инсулина в поджелудочной железе вначале образуется
предшественник инсулина, так называемый проинсулин. Этот проинсулин
состоит из А-цепи, В-цепи и С-пептида, состоящего из 35 аминокислотных
остатков.С-пептид отщепляется под действием карбоксипептидазы и трипсина и
проинсулин переходит в активный инсулин.
Есть разные способы получения инсулина. Мы остановимся на получении
инсулина биосинтетическим путем, с точки зрения преимущества этого метода.
Итак, преимущества получения инсулина биосинтетическим путем.
До внедрения в промышленность метода получения инсулина с
использованием рекомбинантных микроорганизмов существовал только один
способ получения инсулина – из поджелудочных желез крупного рогатого скота
и свиней. Инсулин, получаемый из поджелудочной железы крупного рогатого
скота отличается от инсулина человека на 3 аминокислотных остатка, а инсулин,
получаемый из железы свиньи, только на один аминокислотный остаток, то есть
он ближе к человеческому инсулину. Тем не менее, при введении белков,
отличающихся по структуре от белков человека даже в таком незначительном
выражении, возможно возникновение аллергических реакций. Такой инсулин,
как чужеродный белок, также может и инактивироваться в крови
образующимися антителами.
Кроме того, для получения 1 килограмма инсулина требуется 35 тысяч голов
свиней (если известно, что годовая потребность в инсулине -1 тонна препарата).
С другой стороны, биосинтетическим путем можно получить такое же
количесвто инсулина, проведя биосинтез в 25 кубовом ферментере, используя
рекомбинантный микроорганизм Escherichia coli.
Биосинтетический метод получения инсулина стал применяться в начале 80-х
годов.
Остановимся на схеме получения рекомбинантного инсулина (фирма Eli Lilli-
Эли-Лилли, Соединенные Штаты Америки):
1. этап Путем химического синтеза были созданы последовательности
нуклеотидов, которые кодируют образование А и В цепей, то есть были
созданы синтетические гены.
2. 11 этап. Каждый из синтетических генов вводят в плазмиды (в одну
плазмиду вводят ген, синтезирующий цепь А, в другую плазмиду вводят
ген, синтезирующий цепь В).
3. 111 этап. Вводят ген, кодирующий образование фермента
бетагалактозидазы. Этот ген включают в каждую плазмиду для того,
чтобы добиться бурной репликации плазмид.
4. 1У этап. Вводят плазмиды в клетку Escherichia coli – кишечной палочки
и получают две культуры продуцента, одна культура синтезирует А-цепь,
вторая В-цепь.
5. V этап. Помещают две культуры в ферментер. В среду добавляют
галактозу, которая индуцирует образование фермента
бетагалактозидазы. При этом плазмиды активно реплицируются,
образуя много копий плазмид и, следовательно, много генов,
синтезирующих А и В цепи.
6. VI этап. Клетки лизируют, выделяют А и В цепи, которые связаны с
бетагалактозидазой. Все это обрабатывают бромцианом и отщепляют
А и В-цепи от бетагалактозидазы. Затем производят дальнейшую
очистку и выделение А и В цепей.
7. VII этап. Окисляют остатки цистеина, связывают и получают
инсулин.
Рис.22
Инсулин, полученный этим путем является человеческим инсулином по своей
структуре. Применение современных методов очистки исключает наличие в
инсулине эндотоксинов и пирогенных примесей.
Дата добавления: 2018-04-04; просмотров: 3746; Мы поможем в написании вашей работы! |
Мы поможем в написании ваших работ!