Биотехнология стероидных гормонов. Традиционные источники получения стероидных гормонов. Проблемы трансформации стероидных структур
Стероидные гормоны являются производными стеролов, синтезируются в надпочечниках, семенниках, яичниках и некоторых других органах и тканях (печень, плацента). К стероидным гормонам относятся кортикостерон, кортизол, альдостерон, прогестерон, эстрадиол, эстриол, тестостерон, а также стерол витамина Д-кальцитриол.
Биосинтез стероидных гормонов
Существует два пути биосинтеза стероидных гормонов. Первый путь состоит в превращении холестерола в стероидные гормоны путём окисления его в прогестерон и, далее, в другие производные последнего. Этот путь реализуется в надпочечных железах под влиянием адренокортикотропного гормона. Второй путь заключается в биосинтезе гормонов из ацетил-КоА, минуя холестерол. Промежуточным продуктом биосинтеза является прогестерон.
Стероиды– производные полициклических спиртов – стеролов, у которых укорочена (окислена) боковая цепь (20-27атомы). Из биологических объектов выделено несколько десятков стероидов. Но только примерно двадцати из них свойственна гормональная функция. Так, в короковом веществе надпочечников продуцируется более 40 различных стероидов, которым присвоено общее название – кортикостероиды. Восемь из них являются гормонами. Наибольшее распространение и значение в организме имеют кортикостерон, 17-оксикортикостерон (кортизол) и альдостерон (в сумме они составляют 4/5 всех кортикостероидов коры надпочечников).
|
|
Кортикостерон– кристаллическое соединение с tпл.=220°С. Растворы препарата оптически активны. В течение суток в надпочечниках синтезируется от 4,9 до 7,9мг кортизола. В норме, содержание кортизола в периферической крови человека составляет 110мкг/л.
Альдостерон– кристаллическое вещество с tпл.=219°С. Растворы препарата оптически активны. В надпочечниках за сутки образуется 0,15-0,4мг альдостерона. На его долю приходится всего 1-2% от суммы кортикостероидов. При недостаточности альдостерона развивается бронзовая болезнь, характеризующаяся резким нарушением минерального обмена.
Тестостерон– кристаллы с tпл.=155°С. Оптически активен. Содержание у человека составляет 21,6мкг/л (сырой ткани).
Эстрадиолкристаллизуется в двух модификациях: в виде перистых листочков с tпл.=175-177°С и в форме призматических игл с tпл.=178,5-179,5°С. Вырабатывается в яичниках в количестве 1мг в сутки. При недостаточности эстрадиола у женщин нарушаются циклы менструации, происходят самопроизвольные выкидыши, развивается ожирение. Эстрадиол оказывает влияние на обмен углеводов, белков и нуклеиновых кислот.
Внедрение биотрансформации в процессы получения стероидных гормональных препаратов вызвало буквально переворот в фармацевтической промышленности, позволив многократно удешевить и сделать эти ценные лекарственные препараты доступными для большинства нужд Для синтеза указанных гормонов используют природные соединения, содержащие стероидную структуру, которую необходимо химически модифицировать перед введением функциональных заместителей того или иного гормона.
|
|
В качестве исходного сырья для производства этих препаратов используются стерины растений (класс фитостеринов). Прежде всего, это — эргостерин, обнаруженный у многочисленных представителей растительного мира, а также у грибов и микроорганизмов.
Особенно много эргостерина в дрожжевых микроорганизмах (для его промышленного получения используют пекарские дрожжи).
Следующий представитель фитостеринов — стигмастерин, который в значительных количествах присутствует в соевом масле и сахарном тростнике. Весьма близок к нему по структуре (i-сито-стерин, отличаясь лишь отсутствием двойной связи в боковой цепи .
Ситостерины присутствуют в больших количествах в хлопковом масле, в зародышах пшеницы, в натуральном каучуке, в сахарном тростнике. Получают ситостерин и при переработке древесины в целлюлозно-бумажном производстве.
|
|
В условиях промышленного производства из ситостерина получают андростендион (АД) путем окисления боковой цепи стерина с образованием 17-кетоандростана с помощью мутантных штаммов Mycobacterium vacca (штаммы, у которых блокированы системы, ответственные за полный распад стероидного скелета). В этой комплексной технологии помимо химических стадий используются методы микробиологической трансформации для введения гидроксильной группы в 1,1-положение стероидной структуры и двойной связи в 1,2-положение. Для этих групп известны альтернативные химические варианты, но они уступают по эффективности биотрансформации из-за многостадийности, более низкого выхода и по экологическим показателям. О высокой региосе-лективности микробиологического отщепления боковой цепи ситостерина (без затрагивания стероидного скелета) свидетельствует высокий выход (70 — 80%) продукта трансформации.
Кроме выхода целевого продукта важным показателем, определяющим экономичность процесса микробиологической трансформации стероидного субстрата, является концентрация стероида в культуральной жидкости. В данном процессе концентрация ситостерина составляет 10—15 г/л, при этом стерин вносится в культуральную жидкость в микронизированном виде. Поскольку стероиды трудно растворимы в воде, то и целевой продукт трансформации — АД на 99 % выделяется в виде кристаллов.
|
|
Это свойство стероида определяет метод его извлечения. Сначала методом фильтрации культуральную жидкость отделяют от биомассы и кристаллов АД. Затем последние растворяют в ацетоне и еще раз фильтруют для отделения от биомассы. Концентрированием ацетонового раствора выделяют АД, который на конечной стадии перекристаллизовывают. Аналитический контроль реакции трансформации ведут отбором проб через определенные временные интервалы и анализом их методом тонкослойной хроматографии на силуфоле в присутствии «свидетелей» — исходного стероида, целевого продукта трансформации и некоторых промежуточных и побочных продуктов, которые участвуют в данном процессе. Дальнейшей химической модификацией АД получают такие препараты, как тестостерон, метилтестостерон, оксипрогестерона капронат, спиронолактон и др.
Биотрансформация стероидов — аэробный процесс глубинной ферментации, для проведения которой используется оборудование, отвечающее высокой степени массообмена. Трансформация может осуществляться как растущей на среде культурой, так и отмытыми от питательной среды клетками микроорганизма. Последний вариант предпочтительнее, поскольку облегчает выделение и очистку целевого продукта. Но, как показала производственная практика, не все микроорганизмы переносят промышленное сепарирование без потери активности; так, представители мукоровых грибов очень чувствительны к сепарированию, тогда как представители несовершенных грибов теряют свою активность незначительно.
Способность трансформировать стероиды обнаружена в самых разных группах микроорганизмов. Используются, как правило, естественные штаммы, выделенные из почвы или из других объектов. Условно можно сказать, что процессы гидроксилирования наиболее распространены среди грибов. Так, процесс гидроксилирования способны осуществлять представители 300 видов микроорганизмов, причем 50 % из них — несовершенные грибы и 20 % — фикомицеты. Бактериальным культурам больше присущи процессы окисления гидроксильных групп до кетонов, восстановление кетонов до оксигрупп, введение в кольцо стероидной молекулы двойных связей.
Наиболее известные lα-гидроксилирующие культуры относятся к родам Absidia, Beanveria, Curvularia, Cunninghamella. Для дегидрирования в положении 1,2 в основном применяют Согупе-bacterium simplex. Для изомеризации с одновременным окислением 3-оксигруппы в 3-кетогруппу широко используются штаммы Corynebacterium mediolanum (sin. Flavobacterium dehydrogenans). Отметим важность этой реакции, поскольку источники сырья (диосгенин, соласодин) содержат 3-оксигруппу, тогда как активные стероидные препараты должны иметь 3-кетогруппу.
Специфическая особенность процесса биотрансформаций — использование чистых культур микроорганизмов. Поэтому все операции по подготовке и выращиванию трансформирующих культур проводят в стерильных условиях. Используют культуру-трансформатор в стадии замедления роста, когда питательные компоненты среды в значительной степени израсходованы, а сильно разросшаяся культура подавляет рост посторонней микрофлоры. Что касается микробиологического контроля, то он осуществляется только на стадии выращивания трансформирующей культуры.
Стероиды — малорастворимые в воде соединения: их растворимость колеблется от 0,3 г/л (гидрокортизон) до 0,01 г/л (ацетонид фторкортексолона). Важным аспектом эффективности процессов трансформации является выбор оптимальной концентрации субстрата, зависящий от биологической доступности последнего. Поэтому трансформационные процессы осуществляют обычно при концентрации субстрата в пределах 1 — 10 г/л, что предполагает нахождение основной массы стероида в твердой фазе. В этом случае необходимым условием является высокая степень предварительного измельчения стероидного субстрата (поступает в среду в микронизированном виде) с использованием ультразвуковых или механических измельчителей. В случае, когда растворимость стероидного субстрата слишком мала для проявления присущей микроорганизму ферментативной активности, задействуют методы, повышающие водорастворимость стероидов.
Первый — подача стероида в растворителе, смешивающемся с водой (ацетоне, метаноле, этаноле, диметилформамиде, диметилсульфоксиде и др.). Ограничением для применения этого метода является токсичность определенных концентраций растворителей.
Второй — использование водорастворимых форм стероидов в виде натриевых солей 2,1-гемисукцинатов или фосфатов. Осложняющим моментом для широкого использования таких модификаций является высокая степень избирательности по отношению к ним со стороны микроорганизмов, например для дегидрирующего микроорганизма Corynebacterium simplex эти формы стероидов оказались недоступны.
Третий метод — заключение стероидов в растворимый комплекс с циклодекстрином. Использование комплекса стероидов с циклодекстрином не имеет ограничений предыдущих методов.
Микробиологическое гидроксилирование — наиболее часто применяемый метод получения стероидных препаратов, так как присутствие гидроксильных групп в 3,11,16,17-положениях молекулы стероида обусловливает, как правило, физиологическую активность для большинства гормональных стероидных препаратов.
Дата добавления: 2018-04-04; просмотров: 7505; Мы поможем в написании вашей работы! |
Мы поможем в написании ваших работ!