Биотехнология стероидных гормонов. Традиционные источники получения стероидных гормонов. Проблемы трансформации стероидных структур



Стероидные гормоны являются производными стеролов, синтезируются в надпочечниках, семенниках, яичниках и некоторых других органах и тканях (печень, плацента). К стероидным гормонам относятся кортикостерон, кортизол, альдостерон, прогестерон, эстрадиол, эстриол, тестостерон, а также стерол витамина Д-кальцитриол.

Биосинтез стероидных гормонов

Существует два пути биосинтеза стероидных гормонов. Первый путь состоит в превращении холестерола в стероидные гормоны путём окисления его в прогестерон и, далее, в другие производные последнего. Этот путь реализуется в надпочечных железах под влиянием адренокортикотропного гормона. Второй путь заключается в биосинтезе гормонов из ацетил-КоА, минуя холестерол. Промежуточным продуктом биосинтеза является прогестерон.

Стероиды– производные полициклических спиртов – стеролов, у которых укорочена (окислена) боковая цепь (20-27атомы). Из биологических объектов выделено несколько десятков стероидов. Но только примерно двадцати из них свойственна гормональная функция. Так, в короковом веществе надпочечников продуцируется более 40 различных стероидов, которым присвоено общее название – кортикостероиды. Восемь из них являются гормонами. Наибольшее распространение и значение в организме имеют кортикостерон, 17-оксикортикостерон (кортизол) и альдостерон (в сумме они составляют 4/5 всех кортикостероидов коры надпочечников).

Кортикостерон– кристаллическое соединение с tпл.=220°С. Растворы препарата оптически активны. В течение суток в надпочечниках синтезируется от 4,9 до 7,9мг кортизола. В норме, содержание кортизола в периферической крови человека составляет 110мкг/л.

Альдостерон– кристаллическое вещество с tпл.=219°С. Растворы препарата оптически активны. В надпочечниках за сутки образуется 0,15-0,4мг альдостерона. На его долю приходится всего 1-2% от суммы кортикостероидов. При недостаточности альдостерона развивается бронзовая болезнь, характеризующаяся резким нарушением минерального обмена.

Тестостерон– кристаллы с tпл.=155°С. Оптически активен. Содержание у человека составляет 21,6мкг/л (сырой ткани).

Эстрадиолкристаллизуется в двух модификациях: в виде перистых листочков с tпл.=175-177°С и в форме призматических игл с tпл.=178,5-179,5°С. Вырабатывается в яичниках в количестве 1мг в сутки. При недостаточности эстрадиола у женщин нарушаются циклы менструации, происходят самопроизвольные выкидыши, развивается ожирение. Эстрадиол оказывает влияние на обмен углеводов, белков и нуклеиновых кислот.

Внедрение биотрансформации в процессы получения стероид­ных гормональных препаратов вызвало буквально переворот в фармацевтической промышленности, позволив многократно уде­шевить и сделать эти ценные лекарственные препараты доступ­ными для большинства нужд Для синтеза указанных гормонов используют природные со­единения, содержащие стероидную структуру, которую необхо­димо химически модифицировать перед введением функциональ­ных заместителей того или иного гормона.

В качестве исходного сырья для производства этих препаратов используются стерины растений (класс фитостеринов). Прежде всего, это — эргостерин, обнаруженный у многочисленных пред­ставителей растительного мира, а также у грибов и микроорга­низмов.

Особенно много эргостерина в дрожжевых микроорганизмах (для его промышленного получения используют пекарские дрож­жи).

Следующий представитель фитостеринов — стигмастерин, ко­торый в значительных количествах присутствует в соевом масле и сахарном тростнике. Весьма близок к нему по структуре (i-сито-стерин, отличаясь лишь отсутствием двойной связи в боковой цепи .

Ситостерины присутствуют в больших количествах в хлопко­вом масле, в зародышах пшеницы, в натуральном каучуке, в са­харном тростнике. Получают ситостерин и при переработке дре­весины в целлюлозно-бумажном производстве.

В условиях промышленного производства из ситостерина полу­чают андростендион (АД) путем окисления боковой цепи стерина с образованием 17-кетоандростана с помощью мутантных штам­мов Mycobacterium vacca (штаммы, у которых блокированы систе­мы, ответственные за полный распад стероидного скелета). В этой комплексной технологии помимо химических стадий использу­ются методы микробиологической трансформации для введения гидроксильной группы в 1,1-положение стероидной структуры и двойной связи в 1,2-положение. Для этих групп известны альтер­нативные химические варианты, но они уступают по эффектив­ности биотрансформации из-за многостадийности, более низко­го выхода и по экологическим показателям. О высокой региосе-лективности микробиологического отщепления боковой цепи си­тостерина (без затрагивания стероидного скелета) свидетельству­ет высокий выход (70 — 80%) продукта трансформации.

Кроме выхода целевого продукта важным показателем, опре­деляющим экономичность процесса микробиологической транс­формации стероидного субстрата, является концентрация стеро­ида в культуральной жидкости. В данном процессе концентрация ситостерина составляет 10—15 г/л, при этом стерин вносится в культуральную жидкость в микронизированном виде. Поскольку стероиды трудно растворимы в воде, то и целевой продукт транс­формации — АД на 99 % выделяется в виде кристаллов.

Это свойство стероида определяет метод его извлечения. Сна­чала методом фильтрации культуральную жидкость отделяют от биомассы и кристаллов АД. Затем последние растворяют в ацето­не и еще раз фильтруют для отделения от биомассы. Концентрированием ацетонового раствора выделяют АД, который на конеч­ной стадии перекристаллизовывают. Аналитический контроль ре­акции трансформации ведут отбором проб через определенные временные интервалы и анализом их методом тонкослойной хро­матографии на силуфоле в присутствии «свидетелей» — исходно­го стероида, целевого продукта трансформации и некоторых про­межуточных и побочных продуктов, которые участвуют в данном процессе. Дальнейшей химической модификацией АД получают такие препараты, как тестостерон, метилтестостерон, оксипрогестерона капронат, спиронолактон и др.

Биотрансформация стероидов — аэробный процесс глубинной ферментации, для проведения которой используется оборудова­ние, отвечающее высокой степени массообмена. Трансформация может осуществляться как растущей на среде культурой, так и отмытыми от питательной среды клетками микроорганизма. По­следний вариант предпочтительнее, поскольку облегчает выделе­ние и очистку целевого продукта. Но, как показала производствен­ная практика, не все микроорганизмы переносят промышленное сепарирование без потери активности; так, представители мукоровых грибов очень чувствительны к сепарированию, тогда как представители несовершенных грибов теряют свою активность незначительно.

Способность трансформировать стероиды обнаружена в самых разных группах микроорганизмов. Используются, как правило, естественные штаммы, выделенные из почвы или из других объек­тов. Условно можно сказать, что процессы гидроксилирования наиболее распространены среди грибов. Так, процесс гидроксилирования способны осуществлять представители 300 видов микроорганизмов, причем 50 % из них — несовершенные грибы и 20 % — фикомицеты. Бактериальным культурам больше присущи процессы окисления гидроксильных групп до кетонов, восстанов­ление кетонов до оксигрупп, введение в кольцо стероидной мо­лекулы двойных связей.

Наиболее известные lα-гидроксилирующие культуры отно­сятся к родам Absidia, Beanveria, Curvularia, Cunninghamella. Для дегидрирования в положении 1,2 в основном применяют Согупе-bacterium simplex. Для изомеризации с одновременным окислени­ем 3-оксигруппы в 3-кетогруппу широко используются штаммы Corynebacterium mediolanum (sin. Flavobacterium dehydrogenans). Отметим важность этой реакции, поскольку источники сырья (диосгенин, соласодин) содержат 3-оксигруппу, тогда как актив­ные стероидные препараты должны иметь 3-кетогруппу.

Специфическая особенность процесса биотрансформаций — использование чистых культур микроорганизмов. Поэтому все опе­рации по подготовке и выращиванию трансформирующих куль­тур проводят в стерильных условиях. Используют культуру-трансформатор в стадии замедления роста, когда питательные компоненты среды в значительной степени израсходованы, а силь­но разросшаяся культура подавляет рост посторонней микрофло­ры. Что касается микробиологического контроля, то он осуще­ствляется только на стадии выращивания трансформирующей культуры.

Стероиды — малорастворимые в воде соединения: их раство­римость колеблется от 0,3 г/л (гидрокортизон) до 0,01 г/л (ацетонид фторкортексолона). Важным аспектом эффективности про­цессов трансформации является выбор оптимальной концентра­ции субстрата, зависящий от биологической доступности послед­него. Поэтому трансформационные процессы осуществляют обычно при концентрации субстрата в пределах 1 — 10 г/л, что предпола­гает нахождение основной массы стероида в твердой фазе. В этом случае необходимым условием является высокая степень предва­рительного измельчения стероидного субстрата (поступает в сре­ду в микронизированном виде) с использованием ультразвуко­вых или механических измельчителей. В случае, когда растворимость стероидного субстрата слишком мала для проявления присущей микроорганизму ферментативной активности, задействуют методы, повышающие водорастворимость стероидов.

Первый — подача стероида в растворителе, смешивающемся с водой (ацетоне, метаноле, этаноле, диметилформамиде, диметилсульфоксиде и др.). Ограничением для применения этого ме­тода является токсичность определенных концентраций раство­рителей.

Второй — использование водорастворимых форм стероидов в виде натриевых солей 2,1-гемисукцинатов или фосфатов. Ослож­няющим моментом для широкого использования таких модифи­каций является высокая степень избирательности по отношению к ним со стороны микроорганизмов, например для дегидриру­ющего микроорганизма Corynebacterium simplex эти формы стеро­идов оказались недоступны.

Третий метод — заключение стероидов в растворимый комп­лекс с циклодекстрином. Использование комплекса стероидов с циклодекстрином не имеет ограничений предыдущих методов.

Микробиологическое гидроксилирование — наиболее часто применяемый метод получения стероидных препаратов, так как присутствие гидроксильных групп в 3,11,16,17-положениях моле­кулы стероида обусловливает, как правило, физиологическую ак­тивность для большинства гормональных стероидных препаратов.

 


Дата добавления: 2018-04-04; просмотров: 7505; Мы поможем в написании вашей работы!

Поделиться с друзьями:






Мы поможем в написании ваших работ!