Гаммаоксимасляной кислоты в структуре канамицина защищающий этот
Антибиотик от инактивации со стороны изоферментов этого антибиотика,
Поэтому этот антибиотик отличается высоким терапевтическим эффектом.
Представить схему амикацина и других антибиотиков.
Теория взаимозаменяемости антибиотиков.
В настоящее время есть 4 группы антибиотиков широкого спектра
действия (β-лактамы, аминогликозиды, фторхинолоны тетрациклины). Если
попробовать запретить применение одной группы (например, группы №1)
антибиотиков, то резистентность к ним исчезает через 10 лет. После
возобновления применения 1-ой группы, запрещают применение 2-ой группы
и т.д.
Но сейчас нельзя исключить ни одной группы антибиотиков из практики
лечения, так как достаточно активных и безопасных антибиотиков еще не
хватает и требуется создавать новые и новые группы,.но, со временем,
наверное, можно применить такую схему чередования разных групп
антибиотиков для повышения терапевтического эффекта.
Известно, что в разных частях бактериальной клетки транспептидаза
пептидогликана как белок неодинакова, с другой стороны, все
многочисленные антибиотики имеют одинаковый механизм действия на
патогенный микроорганизм, поэтому в рекомендациях по применению
антибиотиков различного характера имеется информация по
взаимодействию их с пенициллинсвязывающими белками (ПБС). Эта
рекомендация связана с иммунитетом человека, принимающего
|
|
|
антибиотики. Если есть информация в рекомендациях по применению, что
новый антибиотик связывается с ПБС-2, то это означает, что клетка
микроорганизма будет активно лизироваться и освобождающиеся
полисахариды в большом количестве будут поступать в кровь, что в свою
очередь работает как пирогенный фактор и ведет к повышению
температуры больного на короткое время. Такие антибиотики могут быть
рекомендованы больным с невысоким уровнем иммунитета (например, это
больные СПИДом). Если же есть информация о ПБС-3, то это означает,
что в результате действия такого антибиотика бактериальная клетка
только временно перестает делиться, оставаясь живой и после отмены
этого антибиотика, она начинает снова свое размножение с большой
активностью и с опасностью возникновения новой инфекции. Для людей с
низким иммунитетом применение таких антибиотиков опасно. Реализуя в
продаже тот или иной антибиотик, вы должны предупреждать врачей о таком факте.
Методы анализа, основанные на использовании моноклональных антител. Иммуноферментный анализ (ИФА). Иммуноферментный анализ (ИФА). Метод твердофазного иммуноанализа (ELISA – enzymlinkedimmunosorbentassay).
в настоящее время широко внедряется в медицинскую практикуметоды иммуноферментного анализа (ИФА), предназначеные для определения низких концентраций разнообразных биологически активных веществ (лекарственных препаратов, гормонов и т.п.) по их иммунохимическим свойствам. Главной их особенностью является применение в качестве метки – фермента – функционально активной биологической молекулы. Принцип метода заключается в том, что для ИФА используют комплексы иммунореагентов: антигенов (АГ) или антител (АТ) с молекулами фермента. Комплекс молекулы фермента с иммунореагентом (АГ или АТ) называется конъюгатом. При этом оба компонента конъюгата: иммунореагент и фермент – сохраняют свою функциональную активность, т.е. могут образовывать иммунные комплексы и расщеплять субстрат соответственно.
|
|
|
Характерными чертами ИФА являются:
1) высокая специфичность, присущая реакциям АГ – АТ, т.е. иммунореагентам;
2) высокая чувствительность, обеспечиваемая ферментом, т.к. молекулы конъюгированного фермента, как и фермента свободного, способны расщеплять множество молекул соответствующего субстрата с образованием легко обнаруживаемых продуктов.
Результаты анализа оцениваются визуально и инструментально по оптической плотности окрашенных продуктов реакции. Для измерения оптической плотности используют спектрофотометрами, или так называемыми ИФА-ридерами.
|
|
|
Различают два вида ИФА: гомогенный и гетерогенный.
Гомогенный ИФА или ИФА без разделения компонентов (EMIT).
С помощью данного метода анализа можно измерить ферментативную активность исследуемого образца без разделения свободных и связанных с АТ меченых АГ.
Суть гомогенного варианта ИФА состоит в ингибировании или индуцировании активности фермента в результате воздействия иммунореагентов. Каталитическая активность фермента зависит его пространственной структуры, обусловленной многочисленными нековалентными и дисульфидными связями, но нековалентные химические связи непрочны и легко разрушаются или ослабляются под влиянием различных факторов. Одним из них являются и дополнительные нековалентные взаимодействия, которые приводят к изменению пространственной структуры молекулы фермента, а, следовательно, и его каталитической активности. Если активность меченых ферментом АГ, связанных с АТ, заметно отличается от активности свободных меченых АГ, то можно измерить ферментативную активность исследуемого образца без разделения свободных и связанных с АТ меченых АГ.
|
|
|
Кроме ферментов при гомогенном ИФА в качестве метки могут быть использованы модуляторы – ингибиторы или индукторы ферментов, способные изменять активность индикаторного фермента. Гомогенный ИФА в основном используют для быстрого определения в биологических жидкостях низкомолекулярных АГ: токсинов, стероидных гормонов, гаптенов и лекарственных препаратов.
Итак, сущность рассматриваемого метода, применяемого для анализа низкомолекулярных антигенов, состоит в следующем. Антиген ковалентно связывают с ферментом вблизи его активного центра так, чтобы фермент, с одной стороны, сохранял свою активность, а с другой – терял ее при связывании антигена с антителом. Последнее происходит в результате блокировки активного центра объемистой молекулой антитела. Модифицированный ферментом антиген смешивают с антителом. К этой смеси добавляют определяемый антиген, который вытесняет модифицированную молекулу из комплекса с антителом. В результате появляется ферментативная активность, величина которой пропорциональна концентрации определяемого вещества.
EMIT применяется в клинической практике для быстрого определения отравлений лекарствами и наркотическими средствами. Метод пригоден для определения многих соединений: гормонов, наркотических средств, барбитуратов и др.
В случае гетерогенного или твердофазного ИФА, называемого также фермент-зависимым иммуносорбентным анализом (ELISA): иммунореагенты (АГ или АТ) фиксируются на твердой фазе. Неприсоединившиеся компоненты реакции легко удаляются при обязательной процедуре отмывания после каждого этапа анализа.
Таким образом, один из компонентов, антитело или антиген, иммобилизуют на поверхности твердого носителя, а определенное вещество (соответственно антиген или антитело) пропускают через колонку с этим носителем, который предварительно был переведен в комплекс с определенным веществом, содержащим ковалентно привязанный фермент-маркер. Определяемое вещество конкурирует с меченным и по концентрации «вымытого» фермента вычисляют количество определяемого вещества. Использование ферментов как маркеров основано на том же принципе, что и при фотоэнзографии: 1 молекула фермента производит много молекул продуктов ферментной реакции, т.е. фактически может детектировать достаточно высокие концентрации этих продуктов и обычными физико-химическими методами.
Данный метод называют анализом с разделением компонентов; он высокочувствительный, простой, широко используется в медико-биологических исследованиях, используются для массовой диагностики вирусных и инфекционных заболеваний, выявления иммунных комплексов, определения изотипов антител.
В качестве твердой фазы для проведения ИФА используют такие материалы, как полистирол, поливинилхлорид, полипропилен, гели декстрана, полиакриламид, агарозы, целлюлозу, нитроцеллюлозу, нейлон и др. Твердая фаза может быть в виде пробирок, планшетов для микротитрования, шариков, пленок. В настоящее время чаще всего используются пластиковые планшеты для титрования с 96 лунками, имеющими плоское дно. Такие планшеты удобны как в работе, так и при оценке полученных результатов на ИФА-ридерах.
Большинство АГ различной химической природы (белки, нуклеиновые кислоты, пептиды, полисахариды, липополисахариды) и АТ самопроизвольно адсорбируется на поверхности пластика. Степень адсорбции зависит от физико-химических свойств молекул, от концентрации в растворе, отношения площади связывания к объему внесенного образца, времени инкубации, температуры.
Лучше всего белки адсорбируются при высоких значениях рН, поэтому обычно для посадки АГ или АТ используют 0,05 М карбонат-бикарбонатный буфер, рН 9,6. Оптимальная концентрация чистых белковых иммунореагентов для сенсибилизации составляет 1 – 10 мкг/мл, при этом в лунки вносят по 50 – 100 мкл раствора иммунореагента. Инкубируют раствор в планшете 12 – 14 ч в холодильнике при 4 °С. Адсорбировавшиеся на пластике АГ или АТ не смываются буфером, содержащем детергент, в то время как несвязавшиеся с твердой фазой молекулы фермента легко удаляются из лунок при отмывании.
Можно применять гетерогенный ИФА и при работе с корпускулярными АГ: клетками бактерий, эукариот, вирусами, хромосомами и т.п. Клетки бактерий прикрепляют на пластиковую поверхность высушиванием. Для укрепления такой связи прикрепившиеся клетки можно зафиксировать 0,1 – 0,25 % глутаровым альдегидом. При такой фиксации лишь незначительная часть эпитопов будет денатурировать.
Наиболее распространенными ферментами-маркерами, применяемыми в ИФА, являются пероксидаза хрена и щелочная фосфатаза, а растворимыми субстратами для этих ферментов – соответственно ортофенилендиаминдигидрохлорид (ОДФ) и N, n-нитрофенилфосфат щелочной (ПНФФ).
Для выявления и количественного определения АГ и АТ применяют различные варианты гетерогенного ИФА с адсорбцией на твердой фазе АТ или АГ. Различают методы последовательного, и конкурентного анализа. На практике чаще всего применяют различные варианты последовательного гетерогенного ИФА.
Наиболее простыми вариантами ИФА, при которых образуются двухслойные иммунные комплексы, являются прямые методы. При проведении прямого ИФА лунки планшета сенсибилизируют АГ или АТ, блокируют оставшиеся свободными места на твердой фазе, после чего в лунки добавляют меченые ферментом АТ или АГ. При этом содержащий фермент иммунореагент связывается с твердой фазой лишь тогда, когда иммунореагенты взаимно комплементарны. Такой вариант ИФА используют для обнаружения АГ в образце, адсорбированном на твердой фазе, а также для контроля качества меченых ферментом АТ, например, антиглобулиновых. В последнем случае на поверхность лунок адсорбируют стандартный специфический АГ и по завершении сенсибилизации, блокировки и отмывок в лунки раститровывают анализируемый конъюгат. После инкубации и отмывания несвязавшихся компонентов в лунки вносят раствор субстрата. По завершении ферментативной реакции полученные результаты сравнивают с референс-образцом конъюгата.
Непрямой метод твердофазного ИФА был разработан в начале 70-х гг. Этот вариант ИФА проводят с использованием антивидовых конъюгатов, что позволяет решать проблемы серодиагностики самых разных заболеваний, имея ограниченный выбор антивидовых иммуноферментных конъюгатов. Кроме того, такой вариант ИФА применяют для повседневного анализа культуральной жидкости гибридом на наличие специфических моноклональных АТ, используя конъюгат, специфичный к иммуноглобулинам мыши.
Для определения в образцах АГ и иммунных комплексов широко применяется «сандвич»-вариант ИФА. «Сандвич»-вариант ИФА проводится по следующей схеме. Высокоаффинные или моноклональные АТ адсорбируют на твердую фазу и блокируют оставшуюся свободной поверхность пластика. Затем в лунки вносят исследуемый материал, положительный и отрицательный контроли. После инкубации и отмывания в лунки вносят конъюгат – меченые ферментом АТ, а также АГ. Далее вносят субстрат и следят за развитием цветной реакции. В ходе работы искомый АГ оказывается «зажатым» между молекулами АТ. Это позволило назвать данный вариант ИФА «сандвич»-вариантом. Понятно, что исследуемый в «сандвич»-варианте АГ должен обладать, как минимум, двумя сходными эпитопами.
Разновидностью «сандвич»-варианта является анализ для выявления АТ и иммунных комплексов. В этом случае ферментную метку присоединяют не к АТ, взаимодействующим с АГ, а к антиглобулиновому реагенту, который связывается с АТ, входящими в состав иммунных комплексов.
Стоит также упомянуть о варианте ИФА, основанном на ингибировании антигеном. Этот метод применяют для выявления и количественного определения АГ в растворе. Стандартный АГ адсорбируют в лунках планшета и подбирают оптимальное разведение конъюгата. Добавление даже минимальных количеств раствора АГ к конъюгату в оптимальном разведении ингибирует взаимодействие меченых АТ с адсорбированным на твердой фазе АГ. Степень ингибирования при этом прямо пропорциональна содержанию АГ в растворе, что позволяет и количественно оценить содержание АГ в растворе. Таким образом, если конъюгат в оптимальном разведении проинкубировать с последовательными разведениями образца, содержащего АГ, после чего внести эту смесь в лунки с адсорбированным АГ, то свободный АГ, связавшись с мечеными АТ, воспрепятствует связыванию этих АТ с АГ на твердой фазе. Следовательно, меньшее количество фермента, входящего в состав конъюгата, свяжется с твердой фазой, что и приведет к ослаблению ферментативной реакции на заключительном этапе анализа.
Варианты ИФА (конкурентный ИФА с адсорбированными и конкурентный ИФА с адсорбированными АТ) основаны на принципе конкуренции за место связывания. Здесь так же, как и в описанном выше случае, сначала необходимо определить оптимальные концентрации иммунореагентов, после чего исследовать тестируемый материал. Реакцию проводят, смешивая и инкубируя исследуемые образцы с меченым ферментом АТ. При наличии в образце АТ, гомологичных адсорбированным на твердой фазе АГ, эти АТ будут конкурировать с коньюгатом за присоединение к АГ. Чем выше концентрация свободных АТ в образце, тем меньше молекул фермента, входящего в состав конъюгата, присоединится к твердой фазе, и ферментативная активность пропорционально снизится.
К недостаткам метода ELISA можно отнести длительность анализа. Высокой экспрессивностью обладают гомогенные методы анализа EMIT.
Схема проведения ИФА:
1. Первый этап любого из рассматриваемых вариантов ИФА заключается в сенсибилизации твердой фазы – лунок планшета для титрования – АГ или АТ. При постановке каждого опыта необходимо предусмотреть положительный и отрицательный контроль. Положительный контроль ставят в лунках, сенсибилизированных стандартными образцами АГ или АТ, отрицательный контроль – в лизированных стандартными образцами АГ или АТ, отрицательный – в лунках, сенсибилизированных растворами, заведомо не содержащими специфического иммунореагента. Кроме того, как правило, несколько лунок отводят для контроля субстрата и контроля конъюгата, при котором выявляют неспецифическое связывание конъюгата.
2. Вслед за сенсибилизацией проводится блокировка свободной поверхности твердой фазы. После адсорбции иммунореагента свободные места на твердой фазе блокируют для предупреждения неспецифичного связывания на последующих этапах ИФА. Для блокировки используют различные белки (чаще всего 1 % раствор бычьего сывороточного альбумина).
3. При выполнении прямого варианта ИФА после сенсибилизации и блокировки в систему вносят меченый ферментом иммунореагент – конъюгат. Условиия и время инкубации устанавливаются эмперически.
4. После инкубации и отмывки в лунки планшета вносят специфический для используемого фермента субстрат и по достижении оптимального окрашивания в лунках с положительным контролем реакцию останавливают и измеряют оптическую плотность растворов на ИФА-ридере при соответствующей длине волны.
Таким образом, чаще всего ИФА используют для определения мест локализации антигенов в гистохимических анализах и их концентраций в биологических жидкостях.
Количественные методы ИФА развиваются с начала 70-х гг. и в настоящее время их используют для определения иммуноглобулинов, гормонов, вирусных и бактериальных антигенов, лекарственных препаратов, антител к различным антигенам. Методы характеризуются чрезвычайно высокой чувствительностью и абсолютной селективностью, что делает их незаменимыми в ранней диагностике и контроле заболеваний.
Что дает медицине применение этих методов? Количество иммуноглобулинов в сыворотке крови человека служит показателем иммунного статуса организма и важным диагностическим признаком при некоторых заболеваниях. Выявление изменений концентрации гормонов – существенная проблема современной эндокринологии. Такой анализ необходим для диагностики и контроля за эффективностью терапии ряда заболеваний. ИФА используют также для определения поверхностного антигена гепатита В и раково-эмбрионального антигена. Появилась возможность обнаруживать на ранних стадиях заболевание печени или злокачественные образования и своевременно применять методы терапии.
Благодаря ИФА стало легче выявлять антитела к различным антигенам в сыворотке крови пациентов. Метод широко используют в диагностике по данным анализа крови, ибо увеличение содержания в организме антител к какому-либо вирусному или бактериальному антигену позволяет на ранних стадиях распознавать природу заболевания. Обычно применяют модификацию ИФА. Предполагаемый антиген связывают с нерастворимым носителем и соединяют с сывороткой крови. Если в ней есть антитела, то они свяжутся с антигеном, на носителе. Затем такой носитель обрабатывают раствором, содержащим меченные ферментом антитела какого-либо животного. Они связываются с попавшими из крови пациента антителами на носителе, в результате чего появляется детектируемая ферментная активность носителя. Такой метод разработан для диагностики бруцеллеза, сифилиса, гельминтоза и т.п.
Для проведения подобных анализов созданы автоматизированные системы, позволяющие исследовать до 1000 сывороток в день. Перспективность ИФА, а также других аналитических методов с использованием ферментов совершенно очевидна. Она обусловлена их уникально высокими чувствительностью и селективностью, простотой оборудования и возможностью автоматизации. Однако лишь немногие из них широко внедрены в практику. Причина этого – в инерции промышленности, производящей оборудование и наборы реактивов.
Моноклональные антитела в диагностике и лечении.
Дата добавления: 2018-04-04; просмотров: 461; Мы поможем в написании вашей работы! |
Мы поможем в написании ваших работ!