Определение антимикробной активности антибиотиков
Для определения антимикробной активности антибиотиков используют тест-
микроорганизмы, в качестве примеров которых можно привести:
Aspergilus niger
Bacillus subtilus
Pseudomonas aerogenosa.
Определение активности антибиотиков проводится методом биологического
титрования. Существует так называемый трехдозный метод с использованием
испытуемого и стандартного раствора раствора). Метод описан в ГФ ХI, т.2.
Применяется также и однодозный метод – с использованием стандартной
кривой по логарифмической сетке. Более подробная информация по этому
вопросу будет представлена в практической части.
Антибиотики – вторичные вещества, т.е. они не всегда выделяются
микробной клеткой. Задача биотехнолога состоит в подборе концентрации
питательных веществ в среде таким образом, чтобы не было слишком
большого роста биомассы, но антибиотик бы продуцировался в достаточных
количествах.
Условия ферментации.
Рис.2.
- в среде не должно быть глюкозы (нельзя использовать легко усвояемые
источники углеводов), используют трудно усвояемые источники углеводов –
например, крахмал.
- в качестве источника аммонийного азота используют соевую муку;
- должна быть небольшая концентрация фосфора.
Любые предшественники для получения антибиотической структуры надо
добавлять не в «0» точке ферментации, а на 2-е, 3-и сутки (если продуцент –
грибы или актиномицеты), когда антибиотики начинают синтезироваться (это
|
|
|
относится, например, и к фенилуксусной кислоте (ФУК) при синтезе
пенициллина, которую добавляют на вторые или третьи сутки биосинтеза
пенициллина).
Предшественники β-лактамных антибиотиков.
β-лактамные антибиотики синтезируются из аминокислот L-цистеин, L -
валин, L -аминоадипиновая кислота, из которых синтезируется LLD-
трипептид (L –валин превращается в D-валин). Из линейного LLD-трипептида
образуется лактамное кольцо, затем образуется пятичленное серосодержащее
кольцо и т.д. Антибиотики не являются продуктом матричного синтеза.
Аминогликозиды синтезируются из глюкозы.
Тетрациклины и макролиды синтезируются с помощью ацетилкоэнзима
А(Ац-КоА) наподобие жирных кислот (с участием приблизительно 22-х
ферментов).
Ферменты синтезирующие антибиотики образуют мультиферментные
комплексы (за счет водородных связей), в которые «входят»
предшественники антибиотика, а «выходит» целая молекула антибиотика (во
внешнюю среду). Эти комплексы располагаются по периферии клетки
продуцента. Таким образом, антибиотики отделяются от других систем
синтеза в клетке, и антибиотик никак не воздействует на свой продуцент (не
|
|
|
ингибирует и не активирует другие процессы). К тому же мембраны
продуцента непроницаемы для вышедшего продуцента, тем самым создавая
условия одностороннего движения антибиотика только во внешнюю среду.
Представить схему.
Механизмы защиты продуцентов от антибиотиков.
Рис.3.
1. антибиотик, синтезируемый продуцентом, не находит в клетке продуцента
мишени (например, это грибы, синтезирующие β-лактамные
антибиотики);
2. антибиотик синтезируется в мультиферментных комплексах, находящихся
на периферии и отделенных от других жизненно важных систем клетки;
3. находящийся внутри клетки антибиотик временно инактивируется с
последующей активацией при выходе из клетки (например, неомицин
фосфорилируется в клетке фосфатазой мембраны). По выходе из клетки,
он дефосфорилируется и активизируется.
Ретроингибирование – это ингибирование синтеза по механизму обратной связи.
Очень важно бороться с ретроингибированием.
Механизм ретроингибирования антибиотиков
Рис. 4.
Когда аминоадипиновая кислота накапливается в достаточном количестве для
клетки, она начинает реагировать с первым ферментом цепочки (ключевым
ферментом), связывается с его аллостерическим центром, в результате чего
|
|
|
изменяется структура активного центра фермента и синтез прекращается. Когда
концентрация аминоадипиновой кислоты снижается, синтез начинается снова.
Если лизина в клетке много, он также может выключить процесс своего
образования, а так как аминоадипиновая кислота – его предшественник и
образуется с лизином в одном метаболическом пути, то ее образование также
прекращается. Биотехнологу для достижения большого выхода целевого
продукта следует работать со штаммами, где разрегулирована (нарушена)
система ретроингибирования.
Механизмы развития резистентности у бактерий.
Плазмиды– носители генов информации (всего около 30 генов). Плазмиды
автономно реплицируются (размножаются) независимо от деления клетки.
Плазмиды могут содержать гены резистентности (устойчивости) к разным
антибиотикам. Плазмиды с генами резистентности легко передаются из клетки в
16
клетку при коньюгации микроорганизмов. При этом двойная нить плазмиды
расходится на две отдельные нити и одна остается в клетке донора, а другая
передается реципиенту. Особенно часто это явление наблюдается в больницах
|
|
|
(внутрибольничная инфекция). Коньюгация м/о может быть не только
внутривидовой, но и межвидовой и даже межродовой; возможна «вспышка» -
вся микрофлора может стать резистентной к антибиотикам. Схема развития
плазмидной резистентности.
Первоисточник генов резистентности находится в почве у почвенных
микроорганизмов – продуцентов антибиотиков. Они могут передаваться через
промежуточных хозяев патогенным микроорганизмам.
Борьба с резистентностью микроорганизмов.
1. β-лактамы инактивируются β-лактамазами, которые расщепляют их β-
лактамное кольцо. Основной путь борьбы с β-лактамазами – создание
молекул, которые не захватываются активным центром β- лактамаз.
Создают полусинтетический антибиотик (например, оксациллин или
метициллин), которые не чувствительны к пенициллазам.
Механизм создания полусинтетических пенициллинов:
а) отщепление бензильного радикала (остается о-аминопенициллановая
кислота – 6АПК).
б) введение других радикалов химическим путем.
Так же идет работа с цефалоспоринами: радикалы присоединяют к 7-
аминоцефалоспориновой кислоте (7АЦК).
После того как новые антибиотики внедряются в практику, они становятся
селективным фоном отбора для резистентности микроорганизмов, таким
образом постепенно создаются резистентные штаммы.
2. Создание ингибиторов β-лактамаз, созданы комбинированные препараты,
содержащие антибиотик и ингибитор β-лактамаз.
Уназин (ампициллин + сульбактам - ингибитор пенициллазы).
Амоксиклав (амоксициллин + клавулановая кислота – ингибитор
Пенициллазы).
Аугментин (амоксициллин + клавулановая кислота но в другом
Соотношении).
Резистентность может существовать также за счет генов клетки Рис.5.
У некоторых клеток есть гены, которые делают мембраны
непроницаемыми для антибиотиков (сужаются поры или снижается их
количество).
Способы борьбы с этой резистнтностью
1. Создан β-лактамный антибиотик Имипинем, который в растворе образует
цвиттер-ион, меньший по размерам, чем пенициллин и легко проникает
через узкие пориновые каналы.
2. Могут быть созданы структуры, которые проникают не через пориновые
каналы, а другим способом, например, с помощью имитации структуры
переносчика. Есть цефалоспорин, имитирующий переносчик железа и,
попадая в клетку, он угнетает синтез пептидогликана, ингибируя
транспептидазу).
-цефалоспорины Ш поколения не расщепляются β-лактамазами, но они
являются индукторами выработки β-лактамаз,
- цефалоспорины 1У поколения (Цефепим)не являются индукторами β-
лактамаз.
Аминогликозидный антибиотик Амикацин имеет фрагмент
Дата добавления: 2018-04-04; просмотров: 764; Мы поможем в написании вашей работы! |
Мы поможем в написании ваших работ!