Техника генноинженерного эксперимента (стадии)



1. Получение ДНК чужеродного фрагмента, который необходимо включить (вклеить) в клетку хозяина. Например, получение ДНК человеческого инсулина.

2. Получение плазмиды из клетки донора

Есть клетка-реципиет (напр. Е. coli ) из которой мы получаем плазмиды ( это элементарная концевая молекула ДНК в 100-1000 раз меньше хромосомы, существует в бактериальных клетках или клетках прокариот, плазмиды несут ограниченное количество генов ( не более 30 ).

Рис.13.

область сайта

3. Конструированиерекомбинантной плазмиды (вектора)

Вектор - рекомбинат ( подготовленная для генно-инженерных манипуляций плазмида или в виде фага или в виде изолированной ДНК или вируса) или часть рекомбинантной ДНК, которая обеспечивает проникновение и дальнейшую репликацию этой ДНК в клетке хозяина.

Вектор получают с помощью рестриктазы ( разрывает фосфодиэфирные связи в строго определенном месте последовательности оснований нуклнеотидной

цепи)

Генному инженеру необходимо для получения рекомбинанта использовать Есог I, т.к. деятельность BSUR I менее выгодно ( шести-частотная последовательность встречается через каждые 44096 раз; четырех частотная последовательность встречается через каждые 250 раз; при более частой последовательности можно изрезать нужный ген ).

Введение фрагмента ДНК (гена человеческого инсулина в плазмиду клетки реципиента (E.coli) : 2 липких конца одного биообъкета и 2 липких конца другого комплементарно воссоединились. Ген инсулина является чужеродным, поэтому может иметь место такое явление как отжиг.

Рис.15.

 

Отжиг - это процесс смещения двух фрагментов ДНК, когджа восстанавливаются только водородные связи и фосфодиэфирные связи не образуются.

Для восстановления фосфодиэфирных связей используют ДНК-лигазы - это ферменты, которые восстанавливают ковалентные фосфодиэфирные связи и таким образом концы однотяжевой линейной молекулы ДНК соединяются с кольцевой молекулой ДНК- плазмидой. Плазмида - это вектор. Так лиганды сшивают, склеивают молекулы ДНК. На этом этапе плазмида называется вектором или транскриптом.

4.    Включение вектора в клетку-реципиент (E.coli)

Условием включения вектора в клетку реципиента является то, что цитоплазматическая мембрана ее должна близко подходить к клеточной стенке, когда вектор входит внутрь клетки через окошечки.

 

5.    Отбор гибридных клонов
Рис. 16.

 

 

Посев идет на питательную среду, содержащую, как пример, бензилпенициллин, при этом вырастают клоны клетки E.coli с маркером в гибридной плазмиде.

У эукариот при образовании молекулы м РНК имеет место процесс сплайсинга (от английского splicing- созревание, сращивание). Ген у эукариот представляется не непрерывный, а мозаичной структуры, содержащей наряду с кодирующими, несущими информацию (так называемые экзоны), также некодирующие, не несущие информацию (интроны) последовательности. Фермент ДНК-зависимая РНК-полимераза катализирует транскрипцию как экзонов, так и интронов. В процессе сплайсинга интроны с помощью ферментов вырезаются, а экзоны после удаления интронов сращиваются. При этом образуется функционирующая м РНК.

У прокариот процесс образования м РНК идет проще. При помощи РНК-полимеразы идет транскрипция соответствующего гена. Процесс сплайсинга у прокариот отсутствует. Образующаяся в процессе транскрипции молекула м РНК уже способна к функционированию.

Рис.18. Матричный синтез у прокариот.фрагмент ДНК - ген

 

 

 

 

Механизмы резистентности бактерий к аминогликозидным антибиотикам. Целенаправленная трансформация аминогликозидов. Амикацин как полусинтетический аналог природного антибиотика бутирозина.

 

Стоимость годовой продукции антибиотиков – 19 миллиардов $.

Выпускаются антибиотики на рынок ежегодно сотнями тысяч тонн.

Антибиотики изменили микрофлору человека. За 50 лет развития

антибиотиков возросла резистентность микроорганизмов (м/о) к ним.

Антибиотики являются «средством преодоления стрессовых ситуаций» для

м/о. Антибиотики для почвенных м/о являются не только средствами

борьбы, они также являются низкомолекулярными «эффекторами» м/о; с их

помощью м/о меняет свой метаболизм при неблагоприятных условиях

(например, спорообразование).

 Антибиотики – случайные продукты м/о.

Плазмида – кольцевая ДНК –циркулирует по микробным популяциям. При передаче плазмиды другому м/о в результате рекомбинаций и мутаций могут синтезироваться

«случайные вещества», из которых образовались антибиотики.

 

Антибиотики являются веществами, которые вырабатываются одними м/о и

подавляют рост других м/о или опухолевых клеток.

 

Полусинтетические антибиотики – это природные антибиотики,

модифицированные ферментативным или химическим путем.

b-лектамные антибиотики.

- пенициллины

-цефалоспорины.

На основе chrysogenum получены полусинтетичесие антибиотики из

пенициллина – полусинтетические пенициллины: оксациллин,

карбенициллин; из цефалоспорина С – цефалоспорины I ,II, III, IY

поколения.

Первичные метаболиты (предшественники) b-лектамных антибиотиков -

три аминокислоты: цистеин, валин, аминоадипиновая кислота.

 

Продуцентами пенициллинов и цефалоспоринов являются грибы.

Penicillum chrysogenum (пенициллины)

Acremonium chrysogenum (цефалоспорины).

 

Грибы– это организмы, которые имеют ядра, митохондрии, клеточную

стенку, содержащую хитин, имеют сложный цикл развития. Помимо

антибиотиков грибы используют для получения иммунодепрессанта –

циклоспорина (продуцент – Tolypocladium inflatum), фузидина– антибиотика,

в основе которого лежит стероидное ядро сердечных гликозидов (продуцент –

гриб Fusidium coccineum ).

 

.

Механизм действия b-лектамных антибиотиков. Они ингибируют синтез

пептидогликана клеточной стенки на последнем этапе, подавляя активность

фермента транспептидазы. Транспептидазы соединяют концы пептидных

цепочек, на концах которых находится D-аланин, а b-лектамные

антибиотики являются аналогами D-аланина и связываются с активным

центром фермента, тем самым инактивируя его. В результате пептидные

цепочки не замыкаются.

 

 

Актиномицеты– это многоклеточные бактерии. Актиномицеты не имеют

ядра (вместо ядра имеется одна замкнутая нить ДНК), т.е. актиномицеты –

прокариоты, не имеют митохондрий, имеют сложный цикл развития.

Всего имеется 12 тысяч природных антибиотиков, из них 9 тысяч

антибиотиков продуцируют актиномицеты. Актиномицеты продуцируют

антибиотики, ингибирующие синтез белка на рибосомах бактериальных

клеток. Такой же механизм у противогрибковых и противоопухолевых

антибиотиков.

Актиномицеты продуцируют следующие группы антибиотиков:

 

Аминогликозиды – ингибируют синтез белка у бактерий, связываясь с малой

рибосомной субъединицей, нарушая правильность считывания кодонов

информационной РНК (иРНК) антикодонами транспортной РНК (тРНК).

-канамицин - Actinomyces kanamycetus

-неомицин - Actinomyces iracie.

Тетрациклины ингибируют белковый синтез, связывая аминоацил –тРНК с

рибосомно-матричным комплексом,

-окситетрациклин – Аctinomyces ninesus/

макролиды гр. эритромицина – связываются с большой субъединицей

рибосомы.

пиранозиды (группы линкомицина – сходны с макролидами, они связываются

с большой субъединицей рибосомы.

- линкомицин – Streptomyces linconiensis/

левомицетин (получают химическим путем) – ингибирует пептилтрансферазу

большой рибосомальной субъединицы.

 

Природный левомицетин (хлорамфеникол) продуцируется Streptomyces

venezuelae.

Рифамицин – Streptomyces mediterranei, на основе рифамицина получен

рифампицин.

Рифампицин подавляет активность ДНК-зависимую РНК-полимеразу и тем

самым блокирует синтез белка на уровне транскрипции.

 

противогрибковые - (полиеновые) антибиотики – образуют поры в

цитопластической мембране грибов, взаимодействуя с ее стерольным

компонентом (эргостеролом). (рис.)

- нистатин - Streptomyces noursei

- леворин – Actinomyces levorus

- амфотерцин - Streptomyces nodosus

 

противоопухолевые антибиотики - угнетают синтез нуклеиновых кислот

клеток микро- и макроорганизмов.

- брунеомицин – Actinomyces albusvar bruneomycini

- митомицин – Streptomyces caespitosus.

 

Бактерии– также способны к образовыванию антибиотиков. Образуют

антибиотики и большинство бацилл, которые являются спорообразующими

бактериями. В медицине применяют полимиксины, продуцируемые

спорообразующими почвенными бактериями Bacillus polymyxa.

 

Полимиксины (полимиксин, грамицидин) по химическому строению

являются сложными соединениями, включающими остатки полипептидов.

Они нарушают развитие цитоплазматической мембраны у бактерий,

повышают ее проницаемость.

 

 


Дата добавления: 2018-04-04; просмотров: 217; ЗАКАЗАТЬ РАБОТУ