Метод учета хромосомных аберраций
При выборе метафазных пластинок для анализа хромосом руководствовались общепринятыми критериями, которые включали следующие положения (Н.П. Бочков с соавт., 1972):
1. равномерность разброса хромосом в различных участках пластинки;
2. отсутствие наложений, мешающих идентификации хромосом;
3. средняя степень спирализации хромосом (хромосомы из группы G не в виде точек, а в виде образований с четким определением центромеры, коротких и длинных плеч);
4. все хромосомы одной и той же метафазной пластинки лежат в одном поле зрения при иммерсионном увеличении;
У каждого ребенка анализировали от 20 до 100 метафазных пластинок. Анализ проводили с определением частоты и типов хромосомных аномалий в кариотипе больных.
Учитывали структурные аберрации хроматидного (одиночные фрагменты, делеции), хромосомного (парные фрагменты, кольцевые хромосомы, удлинение центромеры, разрыв по центромере) и геномного (полиплоидные клетки, преждевременное расхождение хроматид, эндоредупликация) типов.
Изучались метафазные пластинки с помощью бинокулярного микроскопа Leica CME (Австрия), окуляр 10х18, объектив 100х, бинокулярная насадка 1,25х.
Методика проведения рутинного и дифференциального G-окрашивания
Препараты окрашиваются краской Романовского-Гимзы, краску разводят дистиллированной водой в концентрации 1:12. Продолжительность рутинной окраски 8-10 мин. Для уточнения цитогенетических нарушений проводится дифференциальное GTG-окрашивание.
|
|
|
Принцип метода: под влиянием трипсина и фосфатно-солевого буфера окрашивание определяет единую линейную дифференцированность структуры хромосом в метафазе митоза.
Ход проведения окрашивания: Если окрашивание проводится в тот же день, что провели раскапывание культуры, то высушенные на воздухе препараты необходимо выдержать в течение 60 минут в термостате при t +37o C. Если препараты окрашивать на следующий день, то нужно оставить их при комнатной температуре на ночь и выдержать в течение 25 минут в термостате при t +37o C. Охладить препараты, затем опустить их на 7-10 секунд в стакан с рабочим р-ром трипсина, который предварительно нагрет до t +22o C. Перенести препараты, не высушивая, в стакан с р-ром NaCl на 10 сек. Затем опустить препараты в стакан с 1% р-ром красителя Гимзы, приготовленном на фосфатном буфере на 20 минут; отмыть остатки краски в стакане с фосфатным буфером. Высушить препараты с помощью осторожного высушивания фильтровальной бумагой.
Статистический анализ результатов
Рассчитываем среднюю арифметическую для сравниваемых групп: необходимо определить частоту аберраций для каждой группы отдельно и сравнить эти показатели с помощью критерия Стьюдента (Г.Ф. Лакин, 1990; Л.А. Атраментова, О.М. Утевская, 2008).
|
|
|
Частоту аберраций находили с помощью средней арифметической
, (2. 1)
где x – отдельные даты, n – количество дат.
Находим ошибку среднего по формуле:
(2. 2)
в этой формуле используется показатель стандартное отклонение (это стандартное отклонение для качественных признаков), которое мы находим по формуле:¶
; 
, (2. 3),
где p% - процент,
m – число объектов относящихся к одной категории,
n – объем выборки.
Ошибку выборочной доли, равной 1 или 0 рассчитывали по формуле:
, (2. 4)
где n – численность выборки.
Средние арифметические мы сравниваем с помощью t-критерия Стьюдента:
, где 
, (2. 5)
и 
- средние арифметические сравниваемых групп, sd – статистическая ошибка разности, которую вычисляют по формуле:
, (2. 6)
где 
и 
- статистические ошибки средних арифметических первой и второй групп.
Число степеней свободы сравниваемых групп 
.
Критерий, необходимый для расчётов, находили по формуле:
|
|
|
; (2. 7)
где 
- критическое значение для 
, 
и 
- табличные значения критерия Стьюдента для 
и 
.
Если 
, то нулевую гипотезу отклоняют на исходно принятом уровне значимости 
(а не ), если 
, разница считается не доказанной.
Достоверность различий рассчитывали также с помощью критерия χ2:
χ2 = 
, (2.8)
где значения a, b, c, d находили из четырехпольной таблицы:
а – число клеток с аберрациями хромосом у больных;
b – число клеток без аберраций у больных;
c - число клеток с аберрациями хромосом у здоровых лиц;
d - число клеток без аберраций у здоровых лиц;
N = a + b + c + d.
Объективность исследования
Анализ хромосомных препаратов больных и здоровых девочек проводился на зашифрованном материале.
Требования биоэтики
Родителям пробандов с патологией в доступной форме объясняют, с какой целью у их детей будет проводиться забор крови из локтевой вены в количестве 1,0 мл. Забор крови производится только при наличии письменного согласия родителей и самих детей с возраста 14 лет. В работе не будут использованы имена, фамилии и т.д. пробандов. Доступ к базе данных имеют только руководитель и ответственный исполнитель НИР. Данные хранятся в ГУ «ИОЗДП НАМН».
|
|
|
Личный вклад исполнителя работы заключался в освоении методики цитогенетического анализа, оценке части препаратов хромосом больных с выявлением частоты и типов хромосомных аберраций; выкопировке данных цитогенетического исследования из лабораторной документации; создании базы данных полученного материала; статистической обработки данных; написании квалификационной работы.
ГЛАВА 3
Дата добавления: 2018-04-04; просмотров: 739; Мы поможем в написании вашей работы! |
Мы поможем в написании ваших работ!