Методы определения лекарственной чувствительности МБТ



ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ «РОССИЙСКИЙ НАЦИОНАЛЬНЫЙ ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ им. Н.И.ПИРОГОВА МИНЗДРАВА РОССИИ»

К А Ф Е Д Р А Ф Т И З И А Т Р И И

 

 

РЕФЕРАТ

 

ТЕМА «Лабораторная диагностика туберкулеза»

 

ФИО: Темурзиева Аминат Ахметовна,

Ординатор кафедры фтизиатрии РНИМУ им. Н.И. Пирогова

 

 

Зав. кафедрой:                                                                  д.м.н., профессор В.А.Стаханов

 

Куратор:                                                                           к.м.н., доцент Н.А. Каторгин

 

Москва 2018г.

  Для правильной постановки диагноза и назначения адекватных схем химиотерапии в лабораториях противотуберкулезных учреждений применяется следующие лабораторные методы диагностики:

1. Современные методы и технологии микробиологической и молекулярно-генетической диагностики туберкулеза:

Методы микроскопии

Диагностическая чувствительность метода микроскопии обычно составляет не более 50% среди впервые выявленных больных ТБ легких, однако если говорить о наиболее инфекционно-опасных больных (у которых бактериовыделение подтверждено культуральным методом), диагностическая чувствительность метода микроскопии в этом случае достигает 90%. Методы микроскопии не позволяют дифференцировать МБТ от НТМБ и дают возможность выявлять КУМ только при наличии по крайней мере 5 000-10 000 бактериальных клеток в 1 мл мокроты. В настоящее время методы микроскопии, обладающие относительно невысокой чувствительностью, тем не менее сохраняют свою актуальность, так как позволяют быстро и с минимальными финансовыми затратами выявлять наиболее эпидемически значимых больных ТБ и оценивать массивность бактериовыделения.

Микроскопия с окраской по Цилю – Нельсену. Метод основан на проникновении карболового фуксина в микробную клетку через мембрану, включающую в себя восково-липидный слой, при одновременном воздействии нагревания и сильного протравливающего действия фенола. Последующее обесцвечивание мазка 25% раствором серной кислоты или 3% солянокислым спиртом приводит к обесцвечиванию всех некислотоустойчивых структур. Обесцвеченные элементы мазка докрашивают 0,3% раствором метиленового синего. Микобактерии не воспринимают обычные анилиновые красители, в результате чего кислотоустойчивые микобактерии окрашиваются в малиново-красный цвет, а другие микробы и клеточные элементы — в голубой. Для исследования мазков, окрашенных по Цилю-Нельсену, используют световой бинокулярный микроскоп с иммерсионным объективом (90- или 100-кратное увеличение) и окуляром с 7- или 10-кратным увеличением. Исследуют 100 полей зрения, что достаточно для выявления в мазке единичных микобактерий. В том случае, если результат такого исследования отрицательный, для подтверждения рекомендуют просмотреть еще 200 полей зрения. Регистрируют результаты, указывая количество обнаруженных кислотоустойчивых микобактерий (КУМ).

В БЛ медицинских организаций фтизиатрического профиля субъекта РФ данный метод является актуальным при необходимости экстренного (в течение 1 ч) выявления больных ТБ и микобактериозом на первичном этапе обследования до госпитализации с целью определения статуса бактериовыделения.

Идентификация выросших микроорганизмов микроскопией с окраскойпо Цилю-Нельсену. При получении роста культуры микроорганизмов на плотной и/или жидкой питательных средах необходимо провести ее идентификацию, а также исключить наличие контаминации посторонней микрофлорой. Метод окраски по Ц – Н может быть использован для идентификации выросших микроорганизмов при отсутствии возможности использования современных молекулярных методов.

Методы люминесцентной микроскопии. Основное преимущество люминесцентной микроскопии перед микроскопией с окраской по Ц – Н состоит в экономии времени, затрачиваемого на просмотр препарата, за счет использования меньших увеличений объектива и, соответственно, возможности просматривать большую площадь мазка в поле зрения.

Диагностическая чувствительность микроскопии с окраской люминесцентными красителями в среднем на 10% выше, чем микроскопии с окраской по Ц – Н. При обработке микобактерий люминесцентными красителями (аурамин, родамин и др.) эти вещества также связываются с воскоподобными структурами микробной клетки. При облучении окрашенных клеток возбуждающим источником света (определённый спектр ультрафиолетового излучения) они начинают светиться оранжевым или ярко-красным светом на черном или тёмно-зелёном фоне. При использовании флюоресцентной микроскопии на просмотр той же площади мазка затрачивают значительно меньше времени, чем при световой микроскопии мазков, окрашенных по Цилю-Нельсену. Опытные микроскопист знают, что окраска клеток смесью аурамина и родамина является в некотором роде специфической для кислотоустойчивых микобактерий, которые в этом случае имеют вид золотистых палочек. Сапрофиты окрашиваются в зеленоватый цвет. Другое важное преимущество метода флюоресцентной микроскопии - возможность обнаруживать изменённые микобактерии, утратившие под влиянием ряда неблагоприятных факторов, в частности интенсивной химиотерапии, свойство кислотоусотойчивости и не выявляющиеся в связи с этим при окраске по Цилю-Нельсену

Светодиодная (LED) микроскопия.LED-технология позволяет сделать микроскопию более доступным анализом за счет более низкой стоимости как самих микроскопов, так и их сервисного обслуживания. Оценка, проведенная ВОЗ, подтвердила диагностическую точность LED-микроскопии по сравнению с традиционной люминесцентной микроскопией и большую эффективность LED по сравнению с микроскопией по Ц – Н.

Культуральные методы

Культуральные методы диагностики (методы посева диагностического материала на питательные среды с последующей идентификацией выросших микроорганизмов) являются основными методами выделения МБТ. Их специфичность превышает таковую микроскопических методов, а предел обнаружения значительно выше: он позволяет выявить МБ при наличии в 1 мл исследуемого диагностического материала нескольких сотен и даже десятков жизнеспособных микроорганизмов. Диагностическая чувствительность культурального метода достигает 70-80% среди впервые выявленных больных ТБ легких. С помощью культурального метода удается выявить на 20-40% больше случаев ТБ с бактериовыделением по сравнению с методом микроскопии среди впервые выявленных больных. Культуральный метод позволяет выделить культуру возбудителя, необходимую для определения его видовой принадлежности и определения спектра и степени ЛУ. Видовая идентификация выделенной культуры с помощью комплекса современных молекулярных методов позволяет сразу же дифференцировать МБТ от НТМБ и неспецифической микрофлоры. Медленный рост МБТ требует значительного времени ожидания результатов исследования. В среднем при посеве диагностического материала от впервые выявленных больных для получения результатов на плотных средах требуется 21-36 дней, на жидких средах – 12-22 дня. Для культивирования микобактерий используют различные питательные среды; плотные, полужидкие, жидкие. Однако ни одна из известных питательных сред не обладает свойствами, обеспечивающими рост всех микобактериальных клеток. В связи с этим для повышения результативности рекомендуют применять одновременно 2-3 питательные среды разного состава.

Культивирование на плотных питательных средах. В качестве стандартной среды для первичного выделения возбудителя туберкулёза и определения его лекарственной чувствительности ВОЗ рекомендует среду Левенштейна-Йенсена. Это плотная яичная среда, на которой рост микобактерий получают на 20—25-й день после посева бактериоскопически положительного материала. Посевы бактериоскопически отрицательного материала требуют более длительного периода инкубации (до 10-12 нед).

В нашей стране широкое распространение получила предложенная Э.Р. Финном яичная среда Финн-II. Она отличается тем, что вместо L-аспарагина в ней используют глутамат натрия, запускающий иные пути синтеза аминокислот микобактерий. Рост появляется на этой среде несколько раньше, а частота выделения микобактерий на 6-8% выше, чем на среде Левенштейна-Йенсена.

Для повышения эффективности бактериологической диагностики внелёгочного туберкулёза целесообразно включать в комплекс питательных сред модифицированные среды Финн-II. Для ускорения роста в питательную среду Финн-II дополнительно вводят натрий тиогликолат 0,05%, снижающий концентрацию кислорода. Для защиты ферментных систем микобактерий от токсичных продуктов перекисного окисления липидов в питательную среду Финн-II вводят антиоксидант α-токоферола ацетат в концентрации 0,001 мкг/мл. Посев диагностического материала производят по стандартной методике.

В противотуберкулёзных лабораториях России используют и другие модификации плотных питательных сред; предложенную Г.Г. Мордовским питательную среду «Новая», разработанные В.А. Аникиным питательные среды А-6 и А-9 и др.

Культивирование на жидкой питательной среде в автоматизированной системе учета роста микроорганизмов. Культивирование на жидкой среде повышает выявление МБ примерно на 10% по сравнению с ППС. В настоящее время широко используются системы с автоматической детекцией учета роста МБ, которые позволяют значительно ускорить получение результата.

В БЛ медицинских организаций фтизиатрического профиля РФ преобладающей является автоматизированная система BACTEC MGIT 960/320. Преимущества автоматизированной системы культивирования BACTEC MGIT 960/320 перед культуральными исследованиями на ППС обеспечиваются высокой эффективностью стандартизованных и сертифицированных по ISO9001 производств реагентов и сред, а также поддержанием стандартных протоколов исследований. Регистрацию роста микроорганизмов осуществляют оптически. В её основе лежит флюоресценция, возникающая при потреблении кислорода микобактериями в процессе роста. Кислородзависимый флюорохромный краситель содержится на дне специальной пробирки и покрыт слоем силикона. Размножение микобактерий приводит к уменьшению количества кислорода в пробирке и снижению его концентрации, что вызывает усиление флюоресценции, которая становится видимой при облучении пробирки ультрафиолетовым светом и автоматически регистрируется фотодатчиками, встроенными в прибор ВАСТЕС- 960. Интенсивность свечения регистрируют в единицах роста (GU— growth units). Данные роста заносятся в компьютер, где их можно сохранить, автоматически. Компьютерный анализ кривых роста может дать информацию о наличии различных пулов микобактерий, в том числе нетуберкулёзных, а также помогает оценить ростовые свойства микобактерий.

В результате внедрения таких систем время появления роста микобактерий значительно сократилось, составляя в среднем 11 дней на ВАСТЕС-960 и 19 дней на MB/Bact против 33 дней на стандартной плотной питательной среде. Необходимо отметить, что эти системы требуют высокой квалификации персонала. Посев материала на жидкие среды обязательно сопровождают посевом на среду Левенштейна- Йенсена, играющую роль дублёра в тех случаях, когда на других средах микобактерии туберкулёза не дают роста.

Посев на жидкие питательные среды настоятельно рекомендуется при проведении диагностических исследований, для обследования впервые выявленных больных и повторных случаев лечения.

Идентификация микобактерий

Идентификация микобактерий по культуральным свойствам. При посеве на ППС на основании скорости роста бактерий, морфологии и окраски колоний можно сделать предварительное заключение о принадлежности культуры либо к комплексу МБТ, либо к НТМБ.

Идентификация микобактерий с помощью биохимических тестов. Дифференциация МБТК и НТМБ основана на их культуральных свойствах и способности расти на дифференциально-диагностических средах. Наиболее часто применяемые: тест на наличие роста на среде, содержащей 1 000 мкг/мл натрия салициловокислого; рост на среде, содержащей 2 мкг/мл гидразида тиофен-2 карбоксиловой кислоты (TCH); рост на среде, содержащей 500 мкг/мл паранитробензойной кислоты; рост на среде, содержащей 5% хлорида натрия. Для дифференциации МБ внутри рода применяют следующие основные биохимические исследования: тест на наличие способности продуцировать никотиновую кислоту (ниациновый тест); тест на наличие нитратредуктазной активности; тест на наличие термостабильной каталазы; тест на наличие пиразинамидазы и др. Для подтверждения наличия либо отсутствия контаминации при культивировании на жидкой/плотной питательной среде проводят посев культур на чашки Петри с кровяным агаром. Наличие роста культуры через 24-72 ч инкубации при +37°С свидетельствует о контаминации материала посторонней микрофлорой.

Методы определения лекарственной чувствительности МБТ

Для определения ЛЧ МБТ в качестве основных рекомендуется использовать фенотипические методы, т.е. культивирование МБТ в присутствии ПТП:

– модифицированный метод пропорций на жидкой питательной среде в системе с автоматизированным учетом роста микроорганизмов;

– метод абсолютных концентраций на ППС Левенштейна – Йенсена;

– нитратредуктазный метод абсолютных концентраций на ППС с использованием реактива Грисса.

 

На жидких питательных средах с использованием анализатора BACTEC MGIT 960/320 проводят определение ЛЧ МБТ к ПТП первого ряда (изониазид, рифампицин, этамбутол, стрептомицин, пиразинамид) и к ПТП второго ряда (амикацин, канамицин, офлоксацин, левофлоксацин, моксифлоксацин, этионамид, протионамид, капреомицин, ПАСК, линезолид).

На ППС Левенштейна – Йенсена проводят определение ЛЧ МБТ методом абсолютных концентраций к ПТП первого ряда (изониазид, рифампицин,этамбутол, стрептомицин) и к ПТП второго ряда (канамицин, офлоксацин, этионамид, протионамид, капреомицин, циклосерин, ПАСК).

Критические концентрации ПТП для определения ЛЧ МБТ на жидких средах:

* для изониазида – 1 мкг/мл;

* для рифампицина – 40 мкг/мл;

* для пиразинамида – 200 мкг/мл;

* для этамбутола – 2 мкг/мл;

* для стрептомицина – 10 мкг/мл;

* для канамицина – 30 мкг/мл;

* для капреомицина – 30 мкг/мл;

* для протионамида – 30 мкг/мл;

* для циклосерина – 30 мкг/мл;

* для ПАСК – 1 мкг/мл;

* для офлоксацина – 2 мкг/мл.

 Определение лекарственной чувствительности НТМБ

Для определения ЛЧ НТМБ рекомендуется использовать метод на основе определения минимальных ингибирующих концентраций препаратов. Метод основан на культивировании выделенной культуры НТМБ в 96-луночном планшете в жидкой питательной среде, содержащей разные концентрации антибактериальных, в том числе и ПТП. Для медленнорастущих и быстрорастущих НТМБ ЛЧ определяется к разному спектру препаратов. Для быстрорастущих НТМБ такими препаратами являются триметоприм/сульфамтоксазол, ципрофлоксацин, моксифлоксацин, цефоксицин, амикацин, доксициклин, тайгециклин, кларитромицин, линезолид, имипенем, цефепим, амоксициллин/клавулоновая кислота, цефтриаксон, миноциклин, тобрамицин.  Для медленнорастущих НТМБ – кларитромицин, ципрофлоксацин, стрептомицин, доксициклин, этионамид, рифабутин, этамбутол, изониазид, моксифлоксацин, рифампицин, триметоприм, амикацин, линезолид. Критические концентрации ПТП для определения ЛЧ НТМБ не разработаны и не утверждены ВОЗ .


Дата добавления: 2020-01-07; просмотров: 640; Мы поможем в написании вашей работы!

Поделиться с друзьями:






Мы поможем в написании ваших работ!