Флуорохромы и флуорохромирование
У подавляющего большинства биологических объектов их собственная неяркая люминесценция не позволяет проводить люминесцентно-микроскопические исследования и для избирательного выявления определённых структур применяют люминесцентные красители - флуорохромы. Некоторые из этих красителей диффузно распределяются в клетках, другие избирательно связываются с определёнными структурами клеток или даже с определёнными химическими веществами.
Известно несколько десятков органических соединений, с успехом используемых в качестве флуорохромов. К ним относятся красители: тиазоловые, хинолиновые, азокрасители и особенно акриловые производные. Хорошими флуорохромами являются некоторые естественные пигменты (хлорофилл, липохромы), алкалоиды (берберин, хинин), углеводороды (бензпирен, дибензаантрацен). Флуорохромы применяются в сильно разведённых водных или спиртовых растворах (от 1:1000 до 1:100000). Углеводороды (бензипрен) растворяют в насыщенном водном растворе кофеина.
Флуорохромирование проводят либо прижизненно, либо на фиксированных препаратах. Прижизненное флуорохромирование в свою очередь может быть осуществлено или на целом животном или растительном организме (путём инъекции или введения с пищей), или на отдельных тканях и клетках. Прижизненное флуорохромирование особенно полезно при исследованиях функционального состояния и физико-химической характеристики органов, тканей, клеток. [3]
|
|
|
Преимущества флуоресцирующих красителей перед обычными цитологическими или гистологическими реактивами заключается прежде всего в возможности применять флуорохромы в самых минимальных количествах и в очень слабых концентрациях (1:100000 – 1:5000000). Благодаря этому химическое, повреждающее воздействие на клетки сводится до минимума, объект изучается в наиболее физиологических условиях. Относительная безвредность флуорохромирования позволяет так же широко использовать метод прижизненной окраски, имеющий большие преимущества, особенно в цито- и гистофизиологии.
Второе крупное достоинство метода флуорохромирования состоит в быстроте работы. Для проведения исследования обычно требуются доли минуты. Даже самая длительная окраска препаратов занимает максимум 20-30 минут. Расход флуоресцирующих красок из-за больших разведений очень невелик.
Выбор флуорохрома диктуется целью исследования, характером объекта, природой флуоресцирующего вещества, его кислотностью, цветом и др.
По физико-химическим свойствам флуоресцентные красители можно разделить на три группы.
1. Щёлочные флуорохромы – характеризуются тем, что находятся в кислой среде в сильно диссоциированном состоянии. Флуоресцирующим компонентом краски является положительно заряженный катион. В сильно щёлочных растворах такие краски находятся в недиссоциированном состоянии.
|
|
|
2. Кислые флуорохромы – диссоциируются в щёлочной среде. Флуоресцирующим компонентом краски является отрицательно заряженный анион.
Электронейтральные флуорохромы – слабо кислые или слабо щёлочные краски, диссоциация которых при флуорохромировании не имеет практического значения, поскольку флуоресцирующими свойствами обладает целая молекула. [5]
ГЛАВА 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Объекты люминесцентной микроскопии
Собственная (первичная) люминесценция присуща только некоторым структурам в исследуемых микроскопических препаратах. Большинство веществ биологического происхождения имеет весьма мало интенсивную голубую, синюю или фиолетовую люминесценцию (максимумы в спектрах люминесценции многих из них лежат в ультрафиолетовой области спектра), поэтому возбуждать люминесценцию биологических объектов необходимо ультрафиолетовым светом, а в качестве «запирающего» светофильтра выбирать такой, который отсекает только ультрафиолет.
|
|
|
Природными люминесцирующими веществами растительной клетки являются хлорофилл, порфирин, фикоэритрин, а также клетчатка, пектин, хитин. Представители разных систематических отделов растений обладают различным набором хлорофиллов и фикобилинов. Диффузное распределение пигментов, специфичное для клеток водорослей, вызывает свечение самих клеток. У высших растений наблюдается свечение пластид. Пигментный состав, а значит и спектральные характеристики, в том числе люминесцентные, одноклеточных водорослей более вариабельны, чем у многоклеточных водорослей и высших растений, и в большей степени зависят от условий обитания, возраста, сезона года и т.д. [1]
Некоторые витамины (А, В2), пигменты (липофусцины, хлорофилл), а так же другие вещества под влиянием более или менее длительного освещения ультрафиолетовым излучением претерпевают фотохимические изменения и перестают люминесцировать. Поэтому микроскопирование таких веществ следует проводить по возможности быстро, часто меняя места наблюдения в исследуемом объекте. [2]
В настоящее время люминесцентная микроскопия находит всё более широкое применение в различных областях научной и практической работы: в вирусологии, гистологии (нормальной и патологической), физиологии, ботанике, онкологии, радиобиологии, а так же при проведении лабораторно-клинических анализов, в санитарных и судебно-медицинских исследованиях. Большой интерес представляет предложенный Кунсом и его сотрудниками исключительно чувствительный люминесцентно-иммунохимический метод меченых антител.
|
|
|
Люминесцентная микроскопия, наряду с другими флуоресцентными методами, применяется в физиологии растений. Часто объектами исследований являются представители растительных сообществ водоёмов: фитопланктона, фитобентоса, фитообрастаний, макрофиты, донные отложения, а также лабораторные культуры водорослей. Например, для тестирования вод различной степени загрязнённости перспективно использовать альгологически чистые культуры зелёных водорослей Scenedesmus quadricauda и Chlorella vulgaris, синезелёной водоросли Microcystis aeruginosa, а так же культуру морской жёлто-зелёной водоросли Phaeodactilum tricornutum. Зелёные и сине-зелёные водоросли повсеместно распространены в водоёмах умеренной зоны, а жёлто-зелёные водоросли широко представлены в морях. [12]
Дата добавления: 2019-11-25; просмотров: 172; Мы поможем в написании вашей работы! |
Мы поможем в написании ваших работ!