Бактериальные биоплёнки. Строение. « Quorumsensing » – механизмы.
Как было показано в предыдущем вопросе, бактериальные колонии (сообщества) не являются совокупностью изолированных клеток, а взаимодействуют между собой определённым образом, проявляя элементы социального взаимодействия на микроуровне. Было показано явление, получившее название Q uorumsensing(«чувство кворума») – это межклеточный механизм бактериального общения, заключающейся в регуляции экспрессии генов (усилении или ослаблении) в зависимости от плотности бактериальной популяции.
Регуляторные системы quorumsensing обычно состоят из 2-х механизмов: небольшой диффундирующей сигнальной молекулы и транскрипционного активаторного белка. По типу quorumsensing регулируется целый ряд важнейших физиологических процессов: биолюминесценция, синтез антибиотиков, факторов вирулентности, перенос конъюгативных плазмид и некоторые другие. Такой тип межмикробного взаимодействия позволяет микробным клеткам тонко реагировать на изменение плотности популяции, меняя параллельно экспрессию определённых генов. Так, патогенным бактериям нужно достичь критической плотности в популяции для эффективного заселения определённых биотопов, эта плотность зависит от содержания в окружающей среде факторов вирулентности.
Социальным поведением бактерий объясняется такое важное понятие в медицине, как формирование биоплёнок. Биопленки представляют собой чётко организованный конгломерат микробных клеток, где они связаны прочно с определённым субстратом, а также друг с другом, и защищены от действия окружающих факторов внеклеточным матриксом.
|
|
|
Биоплёнки очень сложно устроены, но главным их элементом является развитая сеть каналов, обеспечивающая доставку веществ в те или иные участки биоплёнки. Биоплёнки важны с медицинской точки зрения тем, что в их составе микроорганизмы по большей части защищены от действия антибиотиков, антисептиков и т.д. Возникновение многих хронических инфекций, возникающих, например, при катетеризации мочевого пузыря, протезировании, при внедрении искусственных клапанов в сердце и т.д., объясняется очень часто формированием биоплёнок на соответствующих поверхностях.
Выделяют 5 стадий развития биоплёнки:
1. Первичное прикрепление микроорганизма (адгезия, сорбция) из жидкости к поверхности. Обычно эта стадия обратима;
2. Окончательное (необратимое) прикрепление, иначе называемую фиксацией. На этой стадии обычно микроорганизмы выделяют внеклеточные полимеры, обеспечивающую прочную фиксацию;
3. Созревание, когда клетки, уже прикрепившиеся, начинают выделять вещества, облегчающие прикрепление последующих клеток. Внеклеточный матрикс прочно удерживает бактериальные клетки в едином каркасе. Накапливаются питательные вещества, и клетки начинают усиленно размножаться;
|
|
|
4. Рост – увеличение размеров биоплёнки, изменение её формы;
5. Дисперсия, когда при интенсивном делении от поверхности биоплёнки часть бактериальных клеток отрывается, и они могут уже сформировать свои колонии.
Бактериологическое исследование
Пожалуй, в наше время трудно найти человека, который хоть раз в жизни не болел бы. Это и бактерии, и различные вирусы. В подавляющем большинстве приём определённых препаратов избавлял нас от тех или иных возбудителей, но есть огромное число заболеваний, при котором важно осуществить идентификацию возбудителя.
«Золотым» стандартоммикробиологической диагностики является бактериологическое исследование, целью которого является накопление чистой культуры и идентификация возбудителя.
Чистая культура – выделенная из определённого источника совокупность микроорганизмов, характеризующаяся одинаковыми морфологическими, тинкториальными, культуральными, биохимическими и антигенными свойствами.
Следует также выделять понятия «штамм» (речь идёт о чистой культуре с набором свойств, отличающих её от других представителей вида) и «клон» (потомков одной бактериальной клетки, полученных в ходе её деления).
|
|
|
Алгоритм бактериологического исследования:
1. Первичная микроскопия (необязательный этап, зависит от характера материала);
2. Первичный посев с целью выделения чистой культуры;
3. Накопление чистой культуры;
4. Изучение комплекса свойств выделенной культуры
Очевидно, что данные действия осуществляются в хронологической последовательности, что соответствует представлению о днях бактериологического исследования (в классическом бак. исследовании 4 дня).
1 день. Осуществляют при необходимости первичную микроскопию. Её можно и не осуществлять, например, в случае фекалий, однако обязательно микроскопируют стерильный в норме материал (биологические жидкости, кроме крови), гнойный материал, мокроту и т.д.
Далее осуществляют первичный посев. Его осуществляют, таким образом, после первичной микроскопии или без неё (кровь, фекалии, моча). Посев осуществляют на соответствующие среды для выделения чистой культуры:
- сахарный бульон, кровяной агар – для стрептококков;
|
|
|
- ЖСА, кровяной агар – для стафилококков;
- среда Эндо – для бактерий семейства Enterobacteriaceae;
- МПА – для грамотрицательных бактерий;
- МПА (посев на конденсационную воду по методу Щукевича) – для выделения протея;
- среда Китта-Тароцци (для выделения анаэробов);
- среда Сабуро – для выделения грибов
Посев является первым этапом бактериологического исследования, если не производилась микроскопия.
2 день исследования. Учёт роста на питательной среде. При этом мы учитываем культуральные свойства. Прежде всего следует указать характер роста: однородный или неоднородный.
Далее охарактеризовать изменения со стороны питательной среды (если она жидкая): диффузное помутнение, поверхностная плёнка и т.д. Если же она плотная, то говорим о колониях, которых традиционно выделяют 2 типа:
- R -колонии (rough – шероховатый) – это матовые шероховатые колонии;
- S -колонии (smouth – гладкий) – гладкие блестящие колонии
Для некоторых микроорганизмов наблюдают так называемую R , S -диссоциацию, когда один вид колонии переходит в другой.
В этот день мы также осуществляем микроскопию мазков по Граму.
В конце осуществляют пересев выделенной чистой культуры на скошенный агар для её накопления.
3 день исследования. Производят учёт роста на скошенном агаре, микроскопируют мазок по Граму (для проверки чистоты культуры).
Очень важным моментом является определение окислительно-восстановительных потенциалов у бактерий, т.е. являются они аэробами или анаэробами. Об аэробном типе извлечения энергии судят по наличию фермента цитохромоксидазы. Для этого с помощью бактериологической петли наносят культуру на индикаторную бумагу, смоченную раствором α-нафтола. О наличии фермента судят по появлению синего окрашивания через 2-5 минут.
Следующим этапом 3 дня является постановка биохимических тестов.
Для выяснения сахаролитической способности микроорганизмов (т.е. способность сбраживать определённые сахара) используют среды Гисса. Они включают пептонную воду, многоатомные спирты, индикатор, определённый углевод и поплавок. Определяют характер углеводного брожения: образуется кислота, кислота и газ, изменений нет (то есть углевод не сбраживается данным микроорганизмом). Для определения сахаролитической активности используют ряд пробирок (обычно с глюкозой, лактозой, маннозой и некоторыми другими) с характерным цветом содержимого, поэтому их иначе называют «пёстрый ряд».
Протеолитические свойства изучают при посеве на желатин и лакмусовое молоко.
Чаще бактерии способны расщеплять не крупные белковые молекулы, а отдельные фрагменты их гидролиза – пептоны. Изучают пептолитические свойства при посеве на мясопептонный бульон (МПБ), при этом образуются индол, аммиак, сероводород и некоторые другие продукты. Обычно в аспекте пептолитических свойств для характеристики микроорганизма указывают 2 пункта: 1) продуцирует или не продуцирует индол; 2) продуцируют или не продуцируют сероводород (см. фото выше).
В заключение третьего дня осуществляют посев на среду Пешкова (для определения подвижности микроорганизмов).
4 день исследования. Осуществляют учёт биохимических тестов, учёт роста на среде Пешкова.
Результаты биохимической идентификации являются основанием для проведения серологической диагностики по реакции агглютинации с соответствующими сыворотками.
В завершении мы можем сказать, найден ли нами этиологический фактор заболевания или нет. При этом следует учитывать критерии этиологической значимости:
- присутствие бактерий в материале в количестве не менее чем 105 КОЕ/мл;
- повторное выделение из материала той же культуры;
- нарастание титра антител в сыворотке больного к аутоштамму в 4 и более раз
Условия культивирования бактерий.
Для культивирования бактерий следует соблюдать ряд условий:
- наличие полноценной питательной среды, которая вне зависимости от вида микроорганизмов должна иметь водную основу, определённое осмотическое давление, pH, а также содержать органические источники углерода;
- определённая температура культивирования;
- атмосфера культивирования. Для понимания такого фактора следует разделить все микроорганизмы на ряд групп по отношению к молекулярному кислороду:
а) облигатные аэробы (обязательно требует для своего размножения кислород), их делят в свою очередь на строгих аэробов (растут при обычном содержании в среде кислорода) и микроаэрофилов (растут в пониженном содержании кислорода, поскольку избыток молекулярного кислорода инактивирует бактериальные ферменты);
б) облигатные анаэробы, которые не используют кислород для извлечения энергии, тип метаболизма у них бродильный. Их делят на две группы: строгие анаэробы, для которых молекулярный кислород токсичен, и они получают энергию путём маслянокислого брожения (клостридии, бактероиды). Вторая группа – аэротолерантные бактерии, которым кислород не нужен, но в его атмосфере они могут существовать (молочнокислые бактерии);
в) факультативные анаэробы, обладающие смешанным типом метаболизма.
Различное отношение микроорганизмов к кислороду определяется их физиологией и набором ферментом. Известно, что молекулярный кислород – базисное соединение для образования активных форм кислорода (АФК), в том числе анионный супероксид-радикал и перекись H2O2.
У строгих аэробов и факультативных анаэробов есть ферменты супероксиддисмутаза и каталаза.
Аэротолерантные бактерии имеют для нейтрализации АФК ионы марганца и фермент пероксидазу.
Строгие анаэробы не имеют специальных ферментных систем антиоксидантной защиты, однако у большинства есть супероксиддисмутаза, и её содержание коррелирует с устойчивостью бактерий к кислороду. Некоторые не выносят даже малейшего присутствия кислорода, для некоторых же (представители рода Clostridium) следовые концентрации допустимы.
Исходя из вышесказанного, можно отметить, что облигатные аэробы и факультативные анаэробы культивируются при достаточном содержании кислорода, а вот облигатные анаэробы в среде с очень низким содержанием кислорода, что достигается несколькими путями:
- добавление в среду веществ, редуцирующих кислород (часто аскорбиновая кислота);
- закупорка пробирок пробками;
- использование газопоглотителей
Дата добавления: 2019-09-13; просмотров: 785; Мы поможем в написании вашей работы! |
Мы поможем в написании ваших работ!