Животные, оборудование, реактивы
Крысы, сенсибилизированные яичным альбумином; эксикатор и эфир для наркоза; хирургический инструментарий; гепарин; бюкс для сбора перитонеальной взвеси; шприц, емкостью 1,0 мл; игла для внутрибрюшинных инъекций; предметное стекло с нанесенными на него заранее, подсушенными на воздухе двумя каплями краски «нейтральной красной»; два покровных стекла; вазелин; раствор антигена; раствор Кребса; две глазные пипетки; микроскоп с окуляром 7, объективами 8 и 40.
 Рис 11.1.
| Для экспериментального изучения патохимической стадии разработана модель дегрануляции перитонеальных тучных клеток (мастоцитов). В гранулах тучных клеток человека и животных содержатся биологически активные вещества и, прежде всего, гистамин. Мембрана тучных клеток имеет на своей поверхности рецепторы, фиксирующие аллергические антитела (иммуноглобулины) – IgE(рис. 11.1а). Взаимодействие фиксированных на тучных клетках антител со специфическим антигеном (рис. 11.1б) сопровождается выходом гранул за пределы клетки –дегрануляцией - и высвобождением содержащихся в них биологически активных веществ (рис. 11.1в). Реакцию дегрануляциитучных клеток можно наблюдать «in vitro», с помощью микроскопа. |
Работа 1.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ИЗУЧЕНИЕ ПРЯМОЙ
РЕАКЦИИ ДЕГРАНУЛЯЦИИ ПЕРИТОНЕАЛЬНЫХ ТУЧНЫХ КЛЕТОК СЕНСИБИЛИЗИРОВАННЫХ ЖИВОТНЫХ
Опыт 1. Получение перитонеального клеточного смыва (перитонеальной взвеси тучных клеток).
|
|
|
Белую крысу, сенсибилизированную яичным альбумином, усыпить эфиром. Для этого на дно эксикатора емкостью 1,5 л положить ватный тампон, обильно смоченный эфиром. Поместить в эксикатор крысу, закрыть эксикатор крышкой и держать крысу в эксикаторе до прекращения у нее дыхания.
Уснувшую крысу извлечь из эксикатора, положить ее на препаровальную дощечку брюшком вверх и ввести внутрибрюшинно 7-8 мл раствора Кребса (рис.11.2).
В течение 1-2 минут мягко массировать пальцами брюшную стенку для получения перитонеального смыва.
рис. 11.2.
| 
рис. 11.3.
|
Вскрыть брюшную полость, сделав с помощью ножниц разрез передней стенки по средней линии живота в средней ее трети длиной 3-3,5 см.
Взять химический стаканчик, ополоснуть его гепарином. Перевернуть крысу над стаканчиком брюшком вниз для того, чтобы перитонеальный смыв стекал в стаканчик по петлям кишечника (рис.11.3).
Полученную таким образом взвесь тучных клеток осторожно взболтать и держать в течение всего опыта при комнатной температуре.
Опыт 2. Постановка теста дегрануляции тучных клеток.
Рис. 11.4
| Взболтать взвесь тучных клеток в течение 15 секунд. Тотчас после взбалтывания с помощью глазной пипетки нанести по капле перитонеальной взвеси на окрашенные нейтральным красным части предметного стекла (рис. 11.4а). К опытной капле взвеси (рис. 11.4 слева) добавить 1 каплю антигена (яичный альбумин). К контрольной капле (рис. 11.4 справа) добавить 1каплю раствора Кребса. Накрыть капли смеси слева и справа покровными стеклами, углы которых предварительно смазаны вазелином. Вазелин должен быть обращен к предметному стеклу (рис. 11.4в). Держать препарат при комнатной температуре 10 минут. |
.
|
|
|
Опыт 3. Микроскопия препарата
Используя объектив 8 и окуляр 7, произвести обзорную микроскопию контрольной капли. Среди неокрашенных лейкоцитов, составляющих большую часть клеток в поле зрения, найти окрашенные в сиреневый цвет тучные клетки. Выбрать поле зрения с относительно большим числом тучных клеток. Сменить объектив 8 на объектив 40. В установленном поле зрения найти интактные и дегранулированные тучные клетки, лейкоциты.
 рис. 11. 5.
| Интактные тучные клетки по диаметру приблизительно в 1,5 раза больше лейкоцитов, имеют правильную круглую или овальную форму. Цитоплазма заполнена окрашенными в сиреневокрасный цвет гранулами. На месте ядра обнаруживается просветление. Оболочка непрерывная, четко контурирует при вращении винта микроскопа (рис. 11.5а) Дегранулированные тучные клетки имеют неровный наружный контур. Цитоплазма их вакуолизирована. На внешнем контуре клеток можно видеть стому, через которую гранулы изливаются наружу (рис. 11.5б). Лейкоциты преобладают в поле зрения. Не окрашены, либо окрашены в светло-желтый цвет. Имеют в диаметре 7-9 мкм (рис. 11.5в). |
|
|
|
Опыт 4. Оценка степени дегрануляции тучных клеток
Ознакомившись с морфологией клеток, подсчитать процент дегранулированных тучных клеток в контрольной капле. Для этого передвигать препарат по ломанной линии до тех пор, пока общее число «случайно попавших» в поле зрение тучных клеток не будет равно 50. Отметить, какое число из них составляют дегранулированные клетки.
После этого произвести микроскопию и подсчет относительного числа дегранулированных тучных клеток в опытной капле взвеси.
Данные занести в таблицу 11.1. Сопоставить процент дегранулированных клеток в опытной и контрольной капле.
Таблица 11.1
Дата добавления: 2018-11-24; просмотров: 292; Мы поможем в написании вашей работы! |
Мы поможем в написании ваших работ!