Концентрации препаратов, используемые при определении лекарственной чувствительности микобактерий туберкулёза методом абсолютных концентраций
На среде Левенштейна-Йенсена
| Препарат | Концентрации, мкг/мл | |
| критическая | предельная | |
| Препараты 1-го ряда | ||
| Дигидрострептомицин | 10 | 25 |
| Изониазид | 1 | 10 |
| Рифампицин | 40 | 80 |
| Этамбутол | 2 | 5 |
| Препараты 2-го ряда | ||
| Канамицин | 30 | 50 |
| Канамицин | 30 | 50 |
| Протионамид (этионамид) | 30 | 50 |
| Циклосерин | 30 | 50 |
| Капреомицин | 30 | 50 |
| Офлоксацин | 2 | 10 |
| Аминосалициловая кислота | 1 | 5 |
Дифференциация микобактерий
Для дифференциации микобактерий комплекса М. tuberculosis ( M. tuberculosis, M. bovis, М. bovisBCG, М. africanum, М. microti, M. canettii и других) от медленно растущих нетуберкулёзных микобактерий применяют основные биохимические тесты, выявляющие наличие следующих признаков:
• способности продуцировать никотиновую кислоту (ниациновый тест);
• нитратредуктазной активности;
• термостабильной каталазы;
• роста на среде с натрием салициловокислым (1 мг/мл).
В качестве дополнительных можно использовать также тесты роста на среде, содержащей 500 мкг/мл паранитробензойной кислоты или 5% хлорида натрия.
Многие бактериологические лаборатории идентифицируют эти микроорганизмы лишь на уровне комплекса, что обусловлено ограниченными возможностями лабораторий и методическими возможностями специалистов.
В большинстве же случаев на практике для дифференциации М. tuberculosis и М. bovis бывает достаточно следующих тестов: ниацинового, на наличие нитратретуктазы, на наличие пиразинамидазы и регистрации роста на среде, содержащей 2 мкг/мл гидразида тиофен-2-карбоксиловой кислоты. При этом учитывают, что микобактерий комплекса М. tuberculosis характеризуются следующей совокупностью признаков:
|
|
|
• медленным ростом (более 3 нед);
• температурой роста в пределах 35-37 °С;
• отсутствием пигментообразования (цвет слоновой кости);
• выраженной кислотоустойчивой окраской;
• положительным ниациновым тестом;
• положительным нитратредуктазным тестом;
• отсутствием термостабильной каталазы (68 °С).
• отсутствием роста на среде Левенштейна-Йенсена, содержащей:
ü 1000 мкг/мл натрия салициловокислого,
ü 500 мкг/мл паранитробензойной кислоты,
ü 5% хлорида натрия;
• ростом в присутствии 1-5 мкг/мл тиофен-2-карбоксиловой кислоты.
Метод полимеразной цепной реакции
ПЦР позволяет амплифицировать (размножить) в пробирке нуклеотидную последовательность (фрагмент ДНК возбудителя) в течение нескольких часов в миллионы раз. Проведение реакции при наличии единичных цепей ДНК определяет исключительно высокую чувствительность анализа.
Нуклеотидная последовательность определённых участков в цепи ДНК определяет генетическое своеобразие микроорганизма, что объясняет высокую специфичность ПЦР.
|
|
|
Значение этого метода для обнаружения и исследования характеристик микобактерии туберкулёза обусловлено биологическими особенностями микроорганизма, обладающего очень медленным ростом: время удвоения ДНК микобактерии туберкулёза при их культивировании составляет 12-24 ч.
Принцип метода ПЦР состоит в амплификации — многократном, в миллионы раз, умножении участков специфической последовательности ДНК в пробирочном микрообъёме при циклическом повторении следующих трёх стадий реакции, каждая из которых проходит в различном температурном режиме:
I стадия — денатурация двухцепочечной ДНК при нагревании с расхождением её цепей;
II стадия — комплементарное связывание (гибридизация) праймеров (затравочных олигонуклеотидов) с концевыми участками цепей строго специфического, избранного для умножения фрагмента ДНК;
III стадия — достройка цепи фрагмента ДНК с помощью термостабильной ДНК-полимеразы.
Для амплификации в пробирке должны быть молекулы матричной ДНК, четыре вида дезоксинуклеозидтрифосфатов (нуклеотидов), содержащих соответствующие азотистые основания: аденин(А), тимин(Т), гуанин(Г), цитозин(Ц); искусственно синтезированные затравочные олигонуклеотиды (праймеры), состоящие из 18-20 пар оснований; термостабильный фермент ДНК-полимераза, имеющий температурный оптимум 68-72 ˚С, и ионы магния.
|
|
|
Для определения генома микобактерий туберкулёзного комплекса наиболее эффективной мишенью амплификации в большинстве тест-систем избран фрагмент ДНК IS6110, который в большинстве штаммов микобактерий туберкулёза имеет в геноме значительное число (10-20) повторов, что обеспечивает, наряду со специфичностью, высокую чувствительность анализа. В то же время описаны штаммы микобактерий туберкулёза с малым числом повторов или отсутствием фрагмента IS6110.
После завершения реакции амплифицированные фрагменты ДНК возбудителя идентифицируют с помощью различных методов.
Хорошо известен метод гельэлектрофореза. При этом полученный фрагмент ДНК идентифицируют по положительному контролю, содержащему искомый специфический фрагмент ДНК, или по заранее известному размеру (числу нуклеотидных пар) фрагмента, который определяют с помощью стандартного молекулярного маркёра.
В присутствии специфического красителя — этидия бромида, включающегося в двухцепочечную ДНК, синтезированный фрагмент ДНК выявляется в виде светящейся под действием ультрафиолета полосы.
|
|
|
Размер фрагмента ДНК, определяемый при электрофорезе по расстоянию пробега от старта, должен соответствовать известному маркёру молекулярного веса или положительному контролю.
Другие методы определения результатов ПЦР основаны на гибридизации одно-цепочечных продуктов ПЦР с комплементарным к ним олигонуклеотидом — ДНК-зондом, меченным биотином, с последующей детекцией с помощью ферментативной реакции посредством, например, связывания с биотином конъюгата стрептавидин-щелочная фосфатаза.
Дата добавления: 2018-10-27; просмотров: 143; Мы поможем в написании вашей работы! |
Мы поможем в написании ваших работ!