Тема: Окраска спорообразующих и капсулообразующих бактерий.
Цель занятия. Овладеть методами окраски спорообразующих, капсулообразующих бактерий.
Материалы и оборудование. Чистые культуры бактерий (Cl. propionicum, Cl. pectonovorum, Bac. mycoides, Bac. cereus, Bac. subtilis, Azotobacter chroococcum) готовые препараты с капсулообразующими бактериями, предметные и покровные стекла, 2% раствор сафранина, водный раствор малахитовой зелени, карболовый фуксин Циля, 0,5% раствор HCl, 5% раствор HСl, 1% водный раствор кристаллического фиолетового, 20% водный раствор сульфата меди (CuSO4 · 5 H2O), фильтровальная бумага, шпатели, микроскоп.
Задание:
- Приготовить мазки из чистых культур микроорганизмов.
- Окрасить мазок по методу Трухильо и Ожешки, промикроскопировать с сухой и иммерсионной системой и зарисовать в тетрадь.
- Окрасить мазок по методу Ольта и Антони, промикроскопировать с сухой и иммерсионной системой и зарисовать в тетрадь.
Методические указания
Окраска спор. При неблагоприятных условиях для микробов (отсутствие питательной среды, высушивание, неблагоприятная температура и др.) в цитоплазме некоторых микроорганизмов образуются споры. Формируются они внутри вегетативной клетки, являясь эндоспорами. Палочковидные грамположительные микроорганизмы, образующие округлые споры, диаметр которых не превышает ширину микробной клетки относятся к роду Bacillus и называются бациллами. Микроорганизмы рода Clostridium имеют споры, диаметр которых превышает ширину микробной клетки, и называются клостридиями. По форме они бывают овальные и круглые.
|
|
|
Споры устойчивы к воздействию высоких температур, химических веществ, к высыханию, длительно сохраняются в почве, что объясняется их особым строением и химическим составом, в особенности ее оболочки. Поэтому споры стойки к действию красителей.
Все методы окраски спор основаны на обеспечении проникновения красителя через трудно окрашиваемую оболочку споры. Поэтому применяют протраву. После охлаждения оболочка вновь становится плотной и не пропускает дополнительный краситель.
Техника окраски спор методом Трухильо. На фиксированный мазок накладывают небольшой кусочек фильтровальной бумаги и на нее наносят водный раствор малахитовой зелени. Подогревают препарат на пламени горелки до появления паров и выдерживают в течение 3 минут, промывают водой и докрашивают 0,25%-ным водным раствором основного фуксина 1 минуту. Промывают водой и высушивают. Микрокартина: споры зеленые, а вегетативные клетки красные.
Техника окраски спор по методу Ожешки.
1. На высушенный на воздухе препарат, не фиксируя, наливают 0,5% раствор HСl и подогревают 2 минуты (до выделения паров); остудив, сливают кислоту, отмывают водой, дают высохнуть и фиксируют жаром на пламени спиртовки.
|
|
|
2. Фиксированный препарат покрывают полоской фильтровальной бумаги и красят карболовым фуксином Циля при подогревании, в течение нескольких минут до появления пара или даже доводя до кипения. По мере испарения добавляют краситель, не давая ему подсохнуть во время подогревания. Затем краситель сливают, а препарат промывают водой.
3. Обесцвечивают препарат 5% раствором HСl (быстрым погружением в стаканчик или ванночку) в течение нескольких секунд, и тотчас промывают в ванночке с водой. Время выдержки в кислоте колеблется в зависимости от препарата от нескольких секунд до нескольких минут. Это время можно определить опытным путем: через короткие промежутки времени препарат вынимают из кислоты; промывают водой, покрывают покровным стеклом и рассматривают с сухой системой микроскопа: если обесцвечивание оказывается недостаточным, то препарат снова обрабатывают кислотой. Эта обработка должна продолжаться до тех пор, пока вегетативные клетки не сделаются почти бесцветными (чуть заметный розовый оттенок не вредит отчетливости микроскопической картины, а при наблюдении без дополнительной окраски метиленовой синью даже полезен), споры же остаются окрашенными в яркий рубиново-красный цвет.
|
|
|
4. Дополнительно препарат окрашивают метиленовой синью. Докрашивание следует производить с большой осторожностью, начиная от самой короткой выдержки под краской, иначе метиленовая синь может проникнуть и в споры и испортить чистоту их окраски. Затем тщательно промывают водой.
В результате всех операций споры окрашиваются в яркий рубиново-красный цвет, вегетативные же клетки в синий или лиловый.
Окраска капсул. Тело микробной клетки покрыто рыхлым слизистым слоем. У некоторых видов микроорганизмов этот слой развивается очень сильно и тогда он называется капсулой. Капсула - муциноподобное вещество, высокомолекулярный полисахарид, является производным наружного слоя оболочки. Наличие капсулы является важным диагностическим признаком при идентификации и дифференциации возбудителей некоторых инфекций (сибирской язвы, пневмококковой пневмонии и др.). Патогенные микроорганизмы образуют капсулу в инфицированном организме. Она является фактором вирулентности и защищает бактериальную клетку от фагоцитоза и бактерицидного действия сыворотки крови.
Слизистые капсулы, образующиеся вокруг тела сапрофитных микробов, появляются обычно при избытке в питательной среде углеводов, усвояемых данным микробом и при недостатке азотистого питания. При наличии капсул клетки не примыкают друг к другу, а находятся на некотором расстоянии. Капсульное вещество плохо окрашивается. Поэтому при приготовлении препарата для обнаружения капсулы выполняют следующие правила:
|
|
|
а) мазок готовят из свежего материала, так как капсула быстро лизируется;
б) фиксируют мазок химическим способом, для окраски применяют метахроматические краски, то есть при использовании которых цитоплазма окрашивается в один цвет, а капсула - в другой;
в) промывать мазок водой следует слабо и кратковременно.
Техника окраска капсул по методу Ольта. Свежий горячий 2%-ный раствор сафранина наносят на фиксированный мазок, окрашивают 5-7 минут. Быстро промывают водой и высушивают. Тело клетки окрашивается в красно-кирпичный цвет, капсула в – желто-оранжевый.
Дата добавления: 2018-10-26; просмотров: 1370; Мы поможем в написании вашей работы! |
Мы поможем в написании ваших работ!