Некаспазный механизм апоптотической гибели.
Помимо каспазного механизма в последние годы различают некаспазный механизм апоптотической гибели (2002), при котором происходит выход из митохондрий и миграция в ядро флавопротеина AIF и эндонуклеазы G, вызывающих распад ядерной ДНК на крупные фрагменты. Наблюдаемые при данном механизме гибели конденсация хроматина и экспозиция фосфатидилсерина во внешнем монослое плазматической мембраны соответствуют признакам апоптоза.
В то время как большинство проапоптических белков вероятно непосредственно противодействуют белкам выживания при помощи их BH3 смертельного лиганда, группа белков Bax может также приводить клетки к смерти путем повреждения органелл. Очень важные свидетельства были предоставлены опытами на дрожжах. Хотя Saccharonoumyces cerevsidae и Shizosaccharomyces pombe, очевидно, не имеют Bcl-2 белков , Ced4 и каспаз , оба они убиваются Bax белком. Bak и Bcl-2 может предохранить от этого, предотвращая разрушение митохондрий. Удаление BH3 домена подавляет токсичность Bax, свидетельствуя о гомодимеризации. Эти открытия, по-видимому, иллюстрируют форму смерти не включающую каспазы, которая вполне может существовать у позвоночных. Даже в присутствии каспазного ингибитора, сверхэкспрессия Bax-подобных белков или их усиленная димеризация убивают клетки млекопитающих, провоцируя конденсацию ДНК и нарушение мембран без активации каспаз или деградации ДНК. Bax и подобные Bax белки могут участвовать в процессах, ведущих к независимой от каспаз смерти за счет активности в образовании каналов, что может изменить проводимость митохондриальных мембран или перфорировать внешнюю мембрану митохондрий. Однако, поскольку свидетельства относительно существования независимой от каспаз смерти главным образом следуют из сверхэкспрессии и наличия химических ингибиторов, их физиологическая значимость остается неясной.
|
|
|
Пути реализации программы апоптоза.
Ø Через клеточный рецептор.
Этот путь передачи сигнала схематически можно изобразить следующим образом: индукторы → рецепторы → адаптеры → каспазы первого эшелона → регуляторы → каспазы второго эшелона. Так, рецептор, обозначаемый Fas, взаимодействуя с соответствующим лигандом (лигандом FasL), трансмембранным белком Т-киллера, активируется и запускает программу смерти клетки, инфицированной вирусом. Тем же путем при взаимодействии с лигандом FasL на поверхности ТН-1-лимфоцитов или с антителом к Fas-рецептору погибают ставшие ненужными выздоровевшему организму В-лимфоциты, продуценты антител, несущие Fas-рецептор. FasL–лиганд относится к многочисленному семейству фактора некроза опухолей (TNF – tumor necrosis factor).
|
|
|
TNF-α и Fas-лиганд (CD178) запускают каскад биохимических реакций, финальным этапом которых является дефрагментация хромосом и гибель клетки. На поверхности клеток организма имеются специальные рецепторы для TNF-α, это TNF-RI (с молекулярной массой 55-60 кДа) и TNF-RII (с молекулярной массой 75-80 кДа), а для Fas-лиганда рецептор Fas/APO-1 (CD95). TNF-R и Fas/APO-1(CD95) имеют гомологию в экстрацеллюлярных доменах, представленную в виде цистеин богатых доменов и гомологичную последовательность в интрацеллюлярной части рецептора. Связывание TNF-α и Fas-лигандов с рецепторами апоптоза активирует интрацеллюлярные "домены смерти" (DED - death effector domain) этих рецепторов: DED, DED1 и DED2 и ряд посредников, включая церамиды, ras, SAPK/JNK, протеиновые тирозинкиназы, катепсин D и протеазы ICE/CED-3 семейства, которые каскадно проводят смертельный сигнал. Цистеиновые протеазы ICE/CED-3 семейства находятся в составе интрацеллюлярной части рецептора апоптоза в неактивной форме, они относятся к интерлейкин-lβ расщепляющим ферментам (ICE)
[Рецепторы смерти - поверхностные рецепторы клетки, которые передают апоптические сигналы инициируемые специфическими "лигандами смерти" - играют главную роль в "инструктивном" апоптозе. Эти рецепторы могут активировать стимулирующие смерть каспазы за время порядка секунд с момента связывания лигандов, вызывая апоптическое разрушение клетки в течение часов.]
|
|
|
Взаимодействие рецептора и лиганда приводит к образованию кластеров рецепторных молекул и связыванию их внутриклеточных участков с адаптерами. Адаптер, связавшись с рецептором, вступает во взаимодействие с эффекторами, пока еще неактивными предшественниками протеаз из семейства каспаз первого эшелона (инициирующих каспаз).
Взаимодействие адаптера с рецептором и эффектором осуществляется через гомофильные белок-белковые взаимодействия небольших доменов: DD (death domain – домен смерти), DED (death-effector domain – домен эффектора смерти), CARD (caspase activation and recruitment domain – домен активации и рекрутирования каспазы). Все они имеют сходную структуру, содержат по шесть a-спиральных участков. Домены DD участвуют во взаимодействии рецептора Fas c адаптером FADD (Fas-associated DD-protein) и во взаимодействии рецепторов TNFR1 и DR3 (death receptor 3) с адаптером TRADD (TNFR1-associated DD-protein). Домены DED участвуют во взаимодействии адаптера FADD с прокаспазами 8 и 10.
Ø Транскрипционный путь.
Так, повреждение ДНК ведет к накоплению в клетке белкового продукта гена р53, который может останавливать деление клеток и/или индуцировать апоптоз. У более чем 50% изученных видов опухолевых клеток ген р53 инактивирован, у них нарушена р53-зависимая регуляция клеточного гомеостаза. Белок р53 является фактором транскрипции, регулирующим активность ряда генов. Предполагается, что ответная реакция на образование белка р53 зависит от степени нарушения клеточного генома. При умеренном нарушении генома происходит остановка клеточного деления, осуществляется репарация ДНК, и клетка продолжает свое существование.
|
|
|
Ø В результате повреждения митохондрий.
В клетках, подвергшихся воздействию индуктора апоптоза, резко снижается мембранный потенциал (Dy) митохондрий. Падение Dy обусловлено увеличением проницаемости внутренней мембраны митохондрий (permeability transition) вследствие образования гигантских пор. Разнообразны факторы, вызывающие раскрытие пор. К ним относятся истощение клеток восстановленным глутатионом, NAD(P)H, ATP и ADP, образование активных форм кислорода, разобщение окислительного фосфорелирования протонофорными соединениями, увеличение содержания Ca2+ в цитоплазме. Образование пор в митохондриях можно вызвать церамидом, NO, каспазами, амфипатическими пептидами, жирными кислотами. Поры имеют диаметр 2,9 нм, позволяющий пересекать мембрану веществам с молекулярной массой 1,5 кДа и ниже. Следствием раскрытия поры является набухание митохондриального матрикса, разрыв наружной мембраны митохондрий и высвобождение растворимых белков межмембранного объема. Среди этих белков – ряд апоптогенных факторов: цитохром с, прокаспазы 2, 3 и 9, белок AIF (apoptosis inducing factor), представляющий собой флавопротеин с молекулярной массой 57 кДа. Прокаспаза-3 обнаруживается как в межмембранном объеме митохондрий, так и в цитоплазме.
Образование гигантских пор не является единственным механизмом выхода межмембранных белков митохондрий в цитоплазму. Предполагается, что разрыв наружной мембраны митохондрий может быть вызван гиперполяризацией внутренней мембраны (ср. с гипополяризацией при раскрытии гигантских пор). Возможен и альтернативный механизм, без разрыва мембраны, – раскрытие гигантского белкового канала в самой наружной мембране, способного пропускать цитохром с и другие белки из межмембранного пространства.
Высвобождаемый из митохондрий цитохром с вместе с цитоплазматическим фактором APAF-1 (apoptosis protease activating factor-1) участвует в активации каспазы-9. Это одно из ключевых событий апоптоза. APAF-1 – белок с молекулярной массой 130 кДа, содержащий CARD-домен (caspase activation and recruitment domain) на N-конце и 12 повторяющихся аминокислотных WD-40-последовательностей (WD – дипептид из триптофана и аспартата) на С-конце, образует комплекс с прокаспазой-9 в присутствии цитохрома с и dATP или АТР (концентрация dATP в клетке в 1000 раз ниже концентрации АТР.
APAF-1 играет роль арматуры, на которой происходит аутокаталитический процессинг каспазы-9. Предполагается, что в результате зависимого от гидролиза dATP (или АТР) конформационного изменения APAF-1 приобретает способность связывать цитохром с. Связав цитохром с, APAF-1 претерпевает дальнейшее конформационное изменение, способствующее его олигомеризации и открывающее доступ CARD-домена APAF-1 для прокаспазы-9, которая тоже содержит CARD-домен. Так образуется конструкция, называемая тоже апоптосомой, с молекулярной массой > 1,3 млн дальтон, в составе которой – не менее 8 субъединиц APAF-1. Благодаря гомофильному CARD-CARD-взаимодействию с APAF-1 в эквимолярном соотношении связывается прокаспаза-9, а затем прокаспаза-9 связывает прокаспазу-3. Пространственное сближение молекул прокаспазы-9 на мультимерной арматуре из APAF-1-цитохром-с-комплексов, по-видимому, приводит к межмолекулярному протеолитическому процессингу прокаспазы-9 с образованием активной каспазы-9.
В зависимости от пути, по которому осуществляется активация каспаз, различают разные типы клеток. Клетки типа I (в частности, линия лимфобластоидных В-клеток SKW и T-клетки линии Н9) подвергаются апоптозу по пути, зависимому от апоптозных рецепторов плазматической мембраны без участия митохондриальных белков. Клетки типа II (например, линии Т-клеток Jurkat и СЕМ) погибают по пути апоптоза, зависимому от митохондриального цитохрома с. Апоптоз, вызванный химиотерапевтическими соединениями, УФ- или і-облучением, по-видимому, напрямую связан с апоптозной функцией митохондрий: клетки, лишенные генов белка APAF-1 или каспазы-9, устойчивы к химио- и радиационной обработке, но погибают при индукции Fas-рецептора.
Ø Комбинированное действие 2 путей - с участием и рецепторов плазматической мембраны и митохондриального цитохрома с.
При чрезмерном нарушении генома, когда ДНК уже не поддается репарации, включаются рецепторный и цитохром с-зависимый апоптозные каскады активации каспаз.
Различные пути апоптоза могут взаимодействовать между собой. В некоторых случаях зависимый от рецепторов путь ведет к малоэффективной активации прокаспазы-8. В этом случае подключается зависимый от митохондрий путь апоптоза: каспаза-8 (образовавшаяся в небольших количествах) взаимодействует в цитоплазме с белком Bid из семейства Bax, расщепляя его надвое. С-Концевой домен Bid далее внедряется в митохондриальную мембрану, индуцируя выход цитохрома с из митохондрий и его связывание с APAF-1.
Ø Через эндоплазматический ретикулум.
Существует путь передачи сигнала апоптоза с участием эндоплазматического ретикулума (ЭР). В ЭПР локализована прокаспаза-12. Нарушение внутриклеточного Ca2+-гомеостаза добавкой тапсигаргина или Ca2+-ионофорного антибиотика А23187 ведет к апоптозу клеток, вызванному превращением прокаспазы-12 в каспазу-12. ЭПР-зависимый апоптоз связан с болезнью Альцгеймера: кортикальные нейроны мышей, дефицитных по каспазе-12, устойчивы к апоптозу, индуцированному І-амилоидным белком, но не к апоптозу с участием рецепторов плазматической мембраны или митохондриального цитохрома с.
Ø Нарушение адгезии клеток.
Взаимодействие клеток с внеклеточным матриксом осуществляется с помощью интегринов. Интегрины – большое семейство гетеродимерных мембранных белков, которые участвуют в адгезии клеток, связывая внутриклеточный цитоскелет с лигандами внеклеточного матрикса. Нарушение адгезии клеток индуцирует апоптоз. Большинство интегринов специфически взаимодействует с трипептидным RGD (аргинин-глицин-аспартат)-мотивом, входящим в состав белков внеклеточного матрикса. Растворимые низкомолекулярные RGD-содержащие пептиды являются эффективными индукторами апоптоза: проникая в клетки, они активируют латентную каспазу-3. Ряд каспаз, включая каспазу-3, содержит RGD-последовательность вблизи активного центра фермента. В молекуле прокаспазы эта последовательность, вероятно, вовлечена во внутримолекулярное взаимодействие, придающее молекуле профермента такую конформацию, при которой протеазная активность не может проявиться. Предположительно RGD-последовательность взаимодействует с последовательностью DDM (аспартат-аспартат-метионин), локализованной вблизи участка протеолитической активации прокаспазы-3. Низкомолекулярный RGD-пептид, проникая в клетку и вступая в конкурентные взаимоотношения с RGD-последовательностью прокаспазы-3, вытесняет ее из сферы взаимодействия с DDM-последовательностью молекул профермента и индуцирует изменение их конформации, олигомеризацию и аутопроцессинг прокаспазы-3 с образованием активной каспазы-3.
Ø Апоптоз эритроцитов – особая форма.
Эритроциты млекопитающих претерпевают особую форму апоптоза. Биогенез эритроцитов из плюрипотентной стволовой клетки в костном мозге включает ряд промежуточных этапов. На этапе эритробласта ядро изгоняется (выталкивается) из клетки и пожирается макрофагом. Альтернативный вариант: кариорексис (деструкция ядра) с образованием телец Жолли и их последующий распад и лизис внутри клетки. Безъядерная клетка, называемая ретикулоцитом, в дальнейшем теряет митохондрии и рибосомы и превращается в эритроцит.
Потерю ядра эритробластом можно рассматривать как особую форму ядерного апоптоза. Выяснение его механизма позволило бы применить его для обезвреживания опухолевых клеток. Эритроцит человека функционирует около 4 месяцев, а затем, поизносившись, исчезает в недрах ретикулоэндотелиальной системы, не причиняя неудобств окружающим клеткам. Лишенный ядра и митохондрий эритроцит, исполнив свое назначение, по-видимому, включает программу гибели, чтобы после этого поступить в распоряжение макрофагов печени и селезенки. Однако ингибитор протеинкиназы стауроспорин и ингибитор синтеза белка циклогексимид (индуцирующий ПКС у большинства испытанных типов клеток млекопитающих) не вызывает ПКС у безъядерных эритроцитов человека. Стауроспорин и циклогексимид, а также отсутствие сыворотки в среде инкубации индуцируют гибель эритроцитов цыпленка (содержащих транскрипционно неактивное клеточное ядро) с выраженными признаками апоптоза по пути, который реализуется без участия каспаз. Сперматозоиды мыши, у которых ядра тоже не обладают активностью в транскрипции ДНК, при инкубации в искусственных средах спонтанно погибают за 1–2 суток; стауроспорин, циклогексимид и пептидный ингибтор каспаз z-VAD.fmk не ускоряют и не замедляют клеточную гибель
Регуляторы апоптоза.
Выделяют ингибиторы и активаторы апоптоза. К ингибиторам относятся: bcl-2, bcl-xL, Mcl-1, bcl-w, аденовирусный E1B 19K, Эпштейн-Барр-вирусный BHRF1. К активаторам относятся bax, bak, Nbk/Bik1, Bad, bcl-xS.
Р53.
Белок р53 является фактором транскрипции, регулирующим активность ряда генов. Предполагается, что ответная реакция на образование белка р53 зависит от степени нарушения клеточного генома. При умеренном нарушении генома происходит остановка клеточного деления, осуществляется репарация ДНК, и клетка продолжает свое существование. При чрезмерном нарушении генома, когда ДНК уже не поддается репарации, включаются рецепторный и цитохром с-зависимый апоптозные каскады активации каспаз.
Ген р53 получил образное имя «страж генома». Продукт р53 гена следит за целостностью генома при митозе. При нарушении целостности генома клетка переключается на апоптоз. Таким образом, р 53 активируется в ответ на самые разнообразные взаимодействия: повреждение ДНК, гипоксия, потеря контактов клетки с субстратом и т.д. На транскрипционном уровне р53 осуществляет одновременно и активацию гена bax, и репрессию гена bcl-2. То есть активация р53 дает мощный апоптогенный сигнал. Важно подчеркнуть, что р53-зависимый апоптоз элиминирует из организма не только поврежденные клетки, но и клетки, в которых наблюдается нерегулируемая стимуляция пролиферации.
Bcl -2.
bcl-2 онкоген, который ингибирует апоптоз, вызванный гормонами и цитокинами, что приводит к повышению жизнеспособности клетки.bcl-2 взаимодействует с bax, при этом при преобладании первого жизнеспособность клетки повышается, при избытке второго — уменьшается. К тому же белки семейства bcl-2 могут взаимодействовать с белками, не относящимися к этой системе. Например, bcl-2 может соединятся с R-ras, который активирует апоптоз. Другой белок, Bag-1, усиливает способность bcl-2 ингибировать апоптоз.
Проницаемость митохондриальной мембраны для AIF и цитохрома с регулируется белками семейства bcl-2 и bcl-х. bcl-2 и bcl-х. – это протоонкогены; протоонкогены – нормальные клеточные гены, усиление или модификации функции которых превращает их в онкогены. Предполагается, что bcl-2 и bcl-х., локализуясь в мембраназ митохондрий, закрывают каналы, через которые осуществляется выброс цитохрома с и/или AIF.
Bax
Белок bax (также из семейства bcl-2) формирует димеры bax-bax, которые усиливают действие активаторов апоптоза. Отношение bcl-2 и bax определяет чувствительность клеток к апоптотическим факторам и является “молекулярным переключателем”, который определяет, будет ли происходит рост или атрофия ткани.
Bax – это опухолевый супрессор; опухолевые супрессоры – это клеточные гены, инактивация которых резко увеличивает вероятность возникновения новообразований, а восстановление функции, наоборот, может подавить рост опухолевых клеток. Bax в норме находится в определенных компартментах цитоплазмы, при апоптогенных сигналах он перемещается в митохондриальные мембраны, где, взаимодействуя с интегральным белком митохондриальной мембраны VDAC, стимулирует открытие канала, через который секретируется цитохрос с.
Апоптоз и болезни человека.
Болезнь Альцгеймера.
Исследователи, изучающие такие разрушительные болезни как болезнь Альцгеймера, хотят использовать любой намек, который может дать надежду на лечение или исправление. Поэтому хотя у них есть несколько верных потенциальных кандидатов обвиняемых в смерти нервных клеток, что обуславливает эту болезнь - наиболее вероятно это токсичный белок, называемый бета-амилоид (Ав). Но неврологи также изучают свидетельства в пользу того, что некоторые из умирающих нейронов выполняют программу самоубийства, называемую апоптозом. Что еще нужно выяснить, это поможет ли замедлить развитие болезни эквивалент вмешательства в процесс клеточного самоубийства. Исследователи обнаружили, что в мозге больных болезнью Альцгеймера имеются умирающие нейроны, обладающие характерными признаками апоптоза, такими как разрывы ДНК. И что кажется даже более интригующим, три белка, связанных с болезнью Альцгеймера - сам бета-амилоид, вместе с двумя другими, называемыми пресенилинами, по-видимому, вводят клетки в апоптоз, когда наступают подходящие условия. Из-за отсутствия хороших моделей этой болезни на животных, никто не мог проверить, могут ли ингибиторы апоптоза предохранить клетки от смерти при болезни Альцгеймера, как это происходит на животных моделях при инсульте. Но если на самом деле апоптоз играет роль в потере нервных клеток, эти открытия могут привести к очень нужным средствам терапевтического лечения болезни Альцгеймера.
Сведения о том, что апоптоз связан с болезнью Альцгеймера, появились в 1993 году из работ двух исследовательских групп - Карла Кетмана из Калифорнийского университета и Ирвина и Джанлуиджи Форлони из института фармакологических исследований в Милане, Италия. Эти группы показали, что бета-амилоид, который образуется в головном мозге людей, страдающих болезнью Альцгеймера, вызывает апоптическую смерть культивируемых нейронов.
Инсульт.
В течение последних нескольких лет исследователи стали подозревать что апоптоз происходит, когда инсульт или сердечная недостаточность приводят к уменьшению снабжения мозга кислородом. Когда снабжение кровью части мозга блокируется, как при инсульте, нейроны в наиболее серьезно поврежденной зоне погибают немедленно от кислородного голодания. Это явление известно как ишемия. Но старой загадкой в нейрологии является вопрос о том, что вызывает более постепенное отмирание (потерю) нейронов в областях внешних по отношению к ядру зоны инсульта, т.е. там, где снабжение кислородом уменьшено, но не отсутствует.
Эксперименты на крысах и мышах дают возможное объяснение: некоторые клетки, которые могли бы иначе восстановиться может быть погибают от ишемии потому, что повреждения запускают их программы самоубийства. Когда исследователи индуцировали ишемию мозга в лабораторных грызунах путем, например, временного купирования кровотока к мозгу животных, они обнаружили там умирающие нейроны, которые имели некоторые ключевые признаки апоптоза. В частности, смерть клеток по-видимому контролируется каспазами, которые организуют выполнение программы смерти клеток. Эти открытия не доказали что умирающие нейроны в действительности претерпевают апоптоз, потому что явления, происходящие с клетками, не полностью соответствуют классическому описанию.
Показано, что ингибитор синтеза белка циклогегсимид (ЦГИ) уменьшает повреждения мозга у лабораторных крыс, у которых вызван экспериментальный инсульт. Известно, что ЦГИ ингибирует апоптоз, однако он является относительно неспецифичным.
Дата добавления: 2018-09-22; просмотров: 284; Мы поможем в написании вашей работы! |
Мы поможем в написании ваших работ!