Свободноживущие азотфиксирующие бактерии

Материалы и оборудование

Фиксированные в формалине корни разных бобовых растений с клубеньками, ботаническая бритва, препаровальные иглы и все необходимое для приготовления препаратов и микроскопирования.

Среди свободноживущих азотфиксирующих бактерий наибольший интерес представляют виды родов Clostridium и Azotobacter.

Вводные пояснения для Clostridium pasteurianum. С. pasteurianum — облигатный анаэроб. Энергию для всех процессов жизнедеятельности, в том числе и ассимиляции атмосферного азота, бактерии этого вида получают за счет маслянокислого брожения (см. 7.1.4). Сбраживают моно-, дисахара и некоторые полисахариды.

В молодой культуре клетки С. pasteurianum имеют форму палочек с перитрихально расположенными жгутиками. Затем клетка образует спору, которая иногда располагается ближе к краю, но чаще — в середине клетки. Споры овальные, окружены капсулой. Клетки имеют клостридиальную форму, накапливают запасное питательное вещество — гранулезу (полисахарид, близкий к крахмалу), которая окрашивается при воздействии раствора Люголя в сине-фиолетовый цвет. В период образования спор гранулеза постепенно исчезает.

Анаэробные азотфиксаторы широко распространены в природе. Они встречаются почти повсеместно в почвах и загрязненных водоемах.

Постановка опыта с С. pasteurianum. Для получения накопительной культурыиспользуют элективную среду Виноградского (г/л дистиллированной воды): глюкоза — 20,0; К₃НРО₄ — 1,0; MgSO₄•7H₂O – 0,5; NaCI - 0,5: СаСО₃ – 20,0. Для учета С. pasteurianum в почве используют среду Емцева следующего состава (г/л дистиллированной воды): NaH₂PO₄ — 0,5; К₂НРО₄ - 0,5; MgSO₄•7H,O - 0,5; NaCI - 0,5; FeSO₄ -0,01; MnSO₄•4H₂O— 0,01; смесь микроэлементов но Федорову (см. 6.2.2) — 1 мл; глюкоза — 20; пептон — 5; дрожжевой автолизат — 0,2 мл; СаСО, — 10; рН 7,0.

Колбу Эрленмейера на 100—150 мл заполняют на 2/3 жидкой средой, предварительно взболтав её. Для инокуляции в среду вносят 1/3 чайной ложки почвы. Элективность среды обеспечивают отсутствие связанного азота и анаэробные условия. Мел добавляют для нейтрализации масляной кислоты. Опыт удобнее ставить в высоких пробирках. Колбы с посевом помещают в термостат при 35—30 °С.

Через несколько дней отмечают помутнение среды и обильное образование газов. На поверхности среды развиваются аэробные микроорганизмы, поглощающие кислород атмосферы. После 4—5 дней инкубации культуру анализируют.

Микроскопирование культуры С. pasteurianum.Содержимое колбы хорошо размешивают и в течение 15—20 с дают осесть грубым частицам, после чего из середины субстрата пипеткой берут немного материала и наносят каплю на предметное стекло. К ней добавляют каплю раствора Люголя, накрывают покровным стеклом и микроскопируют с иммерсионной системой. В клетках С. Pasteurianum, содержащих гранулёзу, она окрашивается в сине-фиолетовый цвет. Как правило, преобладают веретенообразные формы (см. рис. 4, ж).

Из продуктов жизнедеятельности, кроме газов (СО₂, Н₂), можно обнаружить масляную кислоту (см. 7.1.4).

Чистую культуруС. pasteurianum выделяют из колоний, полученных при посеве накопительной культуры после обязательной ее пастеризации на агаризованную среду Виноградского или на картофельно-морковный агар Емцева: картофельный отвар — 500 мл; морковный отвар — 500 мл; глюкоза — 20 г; К₂НРО₄ — 1 г; MgSO₄•7H₂O - 0,5 г; NaCI, MnSО₄ • 4Н₂О, FeSО₄•7И₂О - следы; пептон — 5 г; дрожжевой автолизат — 0,02 мл; СаСО₃ — 40 г; агар — 6 г. Отвары готовят следующим образом: по 0,5 кг очищенных картофеля и моркови заливают 2 л дистиллированной воды, кипятят 10 мин, фильтруют, затем добавляют дистиллированную воду до первоначального объема.

Дата добавления: 2014-01-04; просмотров: 4065; Мы поможем в написании вашей работы!

Поделиться с друзьями:

Мы поможем в написании ваших работ!