Получение витамина D из эргостерина

Nbsp;

Способы повышения эффективности ферментации в биотехнологическом процессе.

Главные условия культивирования микробов в целях получения большинства первичных и вторичных метаболитов следующие:

Необходимость применения специальных биореакторов, в которых возможно поддержание асептических условий в течение сравнительно длительного времени.

Видовые различия биообъектов, с которыми связаны специфические характеристики питательных сред, кардинальные точки температуры и рН.

Невозможность одновременного поддержания постоянства критериев химического, теплового, диффузного и гидродинамического подобия, с чем связаны трудности масштабирования биотехнологических процессов.

Необходимость перемешивания культуральных жидкостей в целях улучшения массообмена.

Микроорганизмы чувствительны к воздействию механических, физических и химических факторов.

Наибольшее биогенное значение для любого живого организма имеет углерод. Он входит в состав всех органических молекул, образующихся в клетки и на его долю приходится в среднем 50% клеточного вещества. По этой причине источники углерода занимают основное место среди компонентов питательных сред.

Продуценты БАВ по своему отношению к источникам углерода являются гетеротрофами, которые в качестве углеродного питания используют углеводы, служащие источником пластического материала и источником энергии.

При микробном синтезе целевых продуктов имеют место индукция, активация, ингибирования, репрессия и некоторые другие регуляторные процессы, усложняющие в целом рефляцию размножения продуцента и биосинтез им конечного продукта.

Отдельные виды микроорганизмов, используемых, в биотехнологических процессах, являются болезнетворными и работа с ними должна проводиться с особой тщательностью.

Некоторые представители микробного мира должны культивироваться только на живых тканях или клетках (куриные эмбрионы, клетки человека и животных и т.д.).

На всех этапах подготовки биообъекта питательные среды перед их засевом должны быть стерильными. Биообъект, или промышленный штамм в идеале должен удовлетворять следующим основным требованиям:

Стабильность структурно-морфологических признаков и физиологической активности при длительном хранении и эксплуатация в производстве.

Повышение скорости роста и биосинтеза целевого продукта в лабораторных и производственных условиях.

Широкий диапазон устойчивости к воздействию неблагоприятных внешних факторов (колебание температуры, рН, аэрация, перемешивание, вязкость среды).

Умеренная требовательность к ограниченному числу источников питания, чем более широкий набор источников углерода, азота и других элементов может использовать производственных штамм, тем легче его культивировать и с большей экономической выгодой.

В действительности каждый штамм имеет свои особенности и не по всем показателям отвечает вышеперечисленным требованиям. Как правило, чем богаче усвояемыми ингредиентами питательная среда, тем лучше растет и метаболирует в ней микроорганизм.

При непрерывном способе глубинного культивирования питательная среда непрерывно подается в ферментатор, в котором создают оптимальные условия для роста микроорганизмов, а из ферментатора также непрерывно вытекает культуральная жидкость, содержащая остатки питательной среды ми клетки микроорганизмов.

Пример:

Основные условия процесса ферментации антибиотиков.

Для успешного проведения процесса ферментации и достижения высокого уровня накопления антибиотика помимо использования оптимальной среды, необходимо соблюдать определенные условия ведения процесса:

не допускать загрязнения культуры продуцента посторонними микроорганизмами, иными словами обеспечить стерильность процесса ферментации;

поддерживать необходимую температуру;

соблюдать оптимальное значение рН среды и культуральной жидкости в процессе ферментации;

обеспечивать культуру достаточным количеством кислорода;

не допускать интенсивного вспенивания.

Стерильность процесса

Отсутствие посторонней микрофлоры (стерильность процесса) при выращивании продуцентов антибиотиков или ферментов является одним из наиболее важных факторов. Для обеспечения стерильности процесса вся аппаратура и коммуникации герметизируются, стерилизуются и держатся под давлением. Питательная среда и поступающий на аэрацию воздух стерилизуются. Засев ферментатора, отбор проб из него производится в асептических условиях, т.е. в условиях, препятствующих попаданию посторонней микрофлоры.

Развитие посторонней микрофлоры опасно во многих отношениях:

Прежде всего, посторонние микроорганизмы, развиваясь в питательной среде, видоизменяют ее и тем самым нарушают оптимальные условия биосинтеза, что приводит к снижению уровня накопления антибиотика.

Наличие посторонней микрофлоры затрудняет дальнейшую обработку культуральной жидкости, отделение её от мицелия и приводит к получению некачественного нативного раствора.

Продукты жизнедеятельности посторонних микроорганизмов могут загрязнять получаемый антибиотик и снижать его качество.

Температура

Для биосинтеза каждого антибиотика требуется определенная температура. Так, для биосинтеза пенициллина грибом Pen. Chlysogenum оптимальной является температура 25-26°С,в то время как при образовании антибиотиков актиномицетами обычно поддерживают более высокую температуру 27-29°С. Однако этот уровень температуры не является наилучшим для биосинтеза всех антибиотиков, которые образуются актиномицетами. При биосинтезе эритромицина культурой S. Erythreus наиболее благоприятной является температура 31- 32°С.

В процессе ферментации вследствие интенсивно протекающих процессов выделяется значительное количество тепла. Поэтому для поддержания температуры на желательном уровне необходимо постоянное охлаждение среды. РН

Для биосинтеза большинства известных антибиотиков оптимальный рН близок к нейтральному. При значительном закислении или защелачивании среды процесс биосинтеза тормозится. Кроме того, многие антибиотики в щелочных или кислых условиях неустойчивы и быстро инактивируются.

Изменение рН среды в процессе ферментации зависит в основном от состава питательной среды и характера процесса метаболизма.

Для регулирования рН в питательные среды для получения антибиотиков часто добавляют некоторое количество мела. Мел реагирует с возникающими в процессе метаболизма кислотами, образуя нейтральные соли и углекислый газ, который удаляется из среды. Поэтому наличие в среде мела предотвращает возможность нежелательного закисления среды.

Аэрация и перемешивание

Все продуценты антибиотиков являются аэробными микроорганизмами и требуют для роста и развития наличия растворенного кислорода.

Во время ферментации происходит одновременно два процесса - растворение кислорода в питательной среде и потребление кислорода микроорганизмом.

Микроорганизмы используют для дыхания только растворенный в среде кислород, поэтому обеспеченность микроорганизма кислородом определяется скоростью его растворения в культуральной жидкости.

При глубинном культивировании микроорганизмов в промышленных масштабах этот процесс осуществляется путем пропускания воздуха через питательную среду и культуральную жидкость с помощью специальных аэрирующих приспособлений - барботеров. При этом жидкость одновременно интенсивно перемешивается.

Основное назначение аэрации и перемешивания - это снабжение культуры кислородом. Однако одновременно эти процессы способствуют поддерживанию мицелия в равномерно взвешенном состоянии и выравниванию концентрации питательных веществ и продуктов обмена в культуральной жидкости

При проведении глубинной ферментации в лабораторных условиях в качалочных колбах степень аэрации зависит от интенсивности перемешивания жидкости в колбе, т.е. от скорости вращения и величины эксцентриситета качалки и объема среды в колбе.

Вспенивание

Питательные среды, применяемые при получении антибиотиков, содержат вещества, способные образовывать весьма стойкие пены. Аналогичные вещества могут возникать в процессе ферментации.

Аэрация и перемешивание среды вызывают образование слоя пены на поверхности жидкости, что ухудшает условия развития продуцента.

Борьба с пенообразованием, т.е. пеногашение, осуществляется главным образом путем добавления поверхностно активных веществ, способствующих снижению стойкости пены и в дальнейшем ее разрушению. В качестве таких веществ в отечественной промышленности применяют различные жиры и растительные масла.

Получение биологически активных веществ микробиологическим синтезом

В технологии получения биологически активных веществ (БАВ) микробиологическим синтезом можно выделить два основных этапа:

ферментация - процесс культивирования микроорганизма-продуцента в определенных условиях и образование целевого продукта;

выделение БАВ и его химическая очистка.

Первой стадией выделения и очистки БАВ является предварительная обработка и фильтрация культуральных жидкостей.

Эта стадия имеет важное значение, так как на этом участке отделяется большая часть примесей сопутствующих БАВ в культуральной жидкости и при этом наблюдаются большие потери целевого продукта (до 20%).

С точки зрения фильтрационных характеристик, культуральная жидкость представляет собой сложную многокомпонентную систему переменного состава.

Получение витамина D из эргостерина.

Витамин D — это группа родственных соединений, в основе которых находится эргостерин, который обнаружен в клеточных мембранах эукариот. Поэтому, например, пекарские или пивные дрожжи применяют для получения эргостерина, как провитамина, обладающего антирахитическим действием. Содержание эргостерина в дрожжевых клетках колеблется в пределах 0,2—11%.

При недостатке в организме гормона 1,25-дигидроксихолекаль-циферола, предшественником которого является витамин D₃ у детей развивается рахит (аналог рахита у взрослых — остеомаляция).

Трансформация эргостерина в витамин D₂ (кальциферол) происходит под влиянием ультрафиолетового облучения. При этом разрывается связь в кольце (позиции 9,10) и образуется двойная связь в боковой цепочке (позиции 22, 23). Эта последняя гидрирована в витамине D₃ (холекальциферол). Физиологическая активность обоих витаминов D₂ и D₃ равноценна.

Кроме дрожжей продуцентами эрогостерина могут быть мицелиальные грибы — аспергиллы и пенициллы, в которых содержится 1,2—2,2% эргостерина. Замечено, что полиеновые антибиотики, действующие на клеточную мембрану дрожжей, заметно стимулируют их содержание в биомассе.

Получение эргостерина в производственных условиях можно подразделить на следующие этапы: размножения исходной культуры и накопление инокулюма, ферментация, сепарирование клеток, облучение клеток ультрафиолетовыми лучами, высушивание и упаковка целевого продукта.

Так, применительно к дрожжам, инокулюм получают на средах, обеспечивающих полноценное развитие клеток, после чего основную среду с ацетатом (активатором биосинтеза стеринов), обогащенную источником углерода и содержащую пониженное количество азота (высокое значение C/N), засевают сравнительно большим объемом инокулята. Культивирование дрожжей (ферментацию) проводят при температуре, близкой к максимальной для конкретного штамма, и выраженной аэрации (2% О₂в газовой фазе). Спустя 3—4 суток, в зависимости от ростовых характеристик и биосинтетической активности культуры, клетки сепарируют и подвергают вакуум - высушиванию. Затем сухие дрожжи облучают ультрафиолетовыми лучами — УФЛ (длина волны 280—300 нм) в течение оптимального по продолжительности времени, при требуемой температуре и с учетом примесных веществ. Эти контролируемые показатели, установленные опытным путем, указываются в регламентной документации. Облучение дрожжей можно проводить до сепарирования клеток в тонком слое 5% суспензии, учитывая малую проникающую способность УФЛ

Облученные сухие дрожжи применяют в животноводстве; в промышленности их выпускают под названием "кормовые гидролизные дрожжи, обогащенные витамином D₂". В таком препарате содержится не менее 46% сырого белка, незаменимые аминокислоты (лизин, метионин, триптофан) и 5000 ME витамина D₂ /г.

В случае получения кристаллического витамина D₂ клетки продуцента гидролизуют соляной кислотой при 110°С, затем температуру снижают до 75—78°С и добавляют этанол. Смесь фильтруют при 10—15°С, оставшуюся после фильтрации массу промывают водой, высушивают, измельчают, нагревают до 78°С и дважды обрабатывают тройным объемом этанола. Спиртовые экстракты объединяют и упаривают до 70%-го содержания сухих веществ. Полученный "липидный концентрат" обрабатывают раствором едкого натра. Эргостерин кристаллизуется из неомыленнной фракции концентрата при 0°С. Его можно очистить повторными перекристаллизациями. Кристаллы высушивают, растворяют в серном эфире, облучают УФЛ, эфир отгоняют, раствор витамина D₂ концентрируют и кристаллизуют.

"Кислотный фильтрат" обычно упаривают до 50%-го содержания сухих веществ и применяют как концентрат В-витаминов. Производят также масляный концентрат витамина D₂.

3.Вакцины на основе рекомбинантных протективных антигенов или живых гибридных носителей.

Перспективы разработки новых вакцин

Говоря о перспективах разработки вакцинных препаратов, следует подчеркнуть, что идеальной вакциной может считаться та, которая при однократном введении непарентеральным методом формировала бы пожизненный протективный иммунитет к большинству актуальных инфекционных болезней, не давая при этом никаких побочных эффектов. В настоящее время не существует препарата, который полностью соответствовал бы указанным выше требованиям, однако к решению такой задачи стремятся все создатели вакцин.

Разработка новых вакцин ведется по следующим основным направлениям:

1. создание комбинированных вакцин на основе существующих монопрепаратов;

2. расширение номенклатуры вакцин;

3. использование новых технологий.

Наиболее реальной перспективой должно стать создание двух базовых многокомпонентных вакцин на основе существующих монопрепаратов.

Одна из них должна основываться на базе АКДС + трехвалентная полиовакцина + вакцина против гепатита В + герпетическая вакцина + конъюгированная вакцина против гемофильной инфенкции типа В.

Вторая базовая вакцина направлена против кори, паротита, краснухи и полиемиелита.

Второе направление

Имеется необходимость в разработке хламидийной вакцины и вакцины против Heliobacter pylori, в создании эффективных вакцин для профилактики грибковых и паразитарных болезней, диарейных заболеваний, вызванных ротавирусами, шигеллами, энтеротоксигенными Е. coli, вакцин против респираторного синцитиального вируса и вируса парагриппа.

В мире нет вакцин против онкологических болезней. В основе противоопухолевого иммунитета лежат клеточные реакции, поэтому попытки лечения онкологических больных только с помощью специфических для опухоли антител, как правило, не приносят успеха. В экспериментальных условиях постоянно испытываются различные варианты вакцин. Наиболее перспективными считаются молекулярно-генетические вакцины, содержащие гены, контролирующие синтез ассоциированных с опухолью антигенов. Такие вакцины проходят испытания в клинике, предварительные данные свидетельствуют о возможности индукции гуморального и клеточного иммунитета.

Следует подчеркнуть тесную связь между инфекционными, прежде всего вирусными, заболеваниями и онкологическими болезнями, так установлена роль вирусов гепатита В и С в развитии первичного рака печени, вируса герпеса и рака шейки матки. Иммунизация против инфекций, вызванных этими вирусами, является одновременно профилактикой онкологических заболеваний.

Третье направление - новые технологии получения вакцин Генноинженерные вакцины

Рекомбинантная технология совершила прорыв в создании принципиально новых вакцин. Принцип создания генноинженерных вакцин заключается в том, что в геном живых аттенуированных вирусов, бактерий, дрожжей или клеток эукариотов (вектор) встраивается ген, кодирующий образование протективного антигена того возбудителя, против которого будет направлена вакцина. Ген встраивается в вектор с помощью высокоспецифических ферментов — рестрикционных эндонуклеаз, разрезающих ДНК вектора в строго определенных местах, и лигаз, вшивающих генную вставку в вектор. Следующий этап заключается в отборе клонов, несущих данный ген, и их размножении.

Получаемые подобным образом клетки могут быть или разрушены с целью выделения и последующей очистки соответствующего антигена - рекомбинантные вакцины, или вводятся в организм - векторные вакцины.

Пример успешной реализации первого подхода — получение HBs-антигена, клонированного в клетках дрожжей. Изготовленная таким способом вакцина вытеснила теперь HBs-вакцину первого поколения, которую приходилось готовить трудоемким методом выделения HBs-антигена из крови носителей вируса и последующей очистки. Новый способ получения позволил снизить и стоимость вакцины.

Привлекательность молекулярного клонирования заключается и в том, что в продукт можно ввести дополнительные последовательности, например необходимые В- и Т-клеточные эпитопы. Вспомним - Т-клеточные эпитопы представлены линейной последовательностью аминокислот, В-клеточные эпитопы имеют трехмерную пространственную конфигурацию. Скомбинированные различным образом эпитопы позволяют оптимизировать иммунный ответ. В процессе создания рекомбинантных вакцин можно выделить несколько стадий:

1. Выделение гена, кодирующего протективный антиген из организма возбудителя заболевания.

2. Внедрение гена в геном организма, продуцента белкового антигена.

3.Культивирование модифицированного микроорганизма in vitro.

4. Выделение и очистка требуемого антигенного продукта, используемого затем, как вакцинный препарат.

Дальнейшее развитие подхода с применением клонирования генов предполагает введение нужного гена в такой вектор, который способен после инъекции в организм образование большого количества антигена. Для создания векторных живых вирусных вакцин используют аттенуированный ДНК-содержащий вирус, в геном которого встраивается необходимый предварительно клонированный ген. Вирус, носитель встроенного гена, попадая в организм животного или человека активно размножается, при этом с вирусной ДНК считывается не только информация о собственно вирусных белках, но и о белке, закодированном во встроенной в вирусный геном ДНК. Белковый продукт встроенного гена обеспечивает формирование иммунитета. Материал, встраиваемый в вирусный геном, может содержать несколько генов. Таким образом, один вирусный вектор может использоваться для создания иммунитета против нескольких инфекций.

Вирусный вектор создает иммунитет против следующих заболеваний:

1 - заболевания, вызываемого данным вирусом;

2 - заболевания, вызываемого инфекционным агентом - хозяином встраиваемой в вирусный геном ДНК.

Экспериментальные векторные вакцины на основе вируса осповакцины получены к ветряной оспе, гриппу А, гепатиту А и В, малярии, простому герпесу. К сожалению, вакцины испытаны преимущественно на животных, которые устойчивы к большинству из этих инфекций. Использование в качестве вектора вируса коровьей оспы осложнено тем, что многие люди уже привиты против оспы и у них этот вирус будет слишком быстро выводиться из организма. В качестве альтернативы предлагались почти все из имеющихся аттенуированных вирусных вакцин.

Другой подход к созданию вакцины заключается в использовании в роли векторов аттенуированных бактерий. Естественным кандидатом на нее представляется вакцина БЦЖ (от франц. BCG — bacille Calmette—Guerin). Геном этих бактерий по расчетам достаточно велик для включения генов любых других микробов. Имеется также ряд мутантных штаммов сальмонелл, способных при пероральном введении проиммунизировать лимфоидную ткань кишечника, прежде чем будут уничтожены иммунной системой. Эти бактерии идеально подходят как векторная вакцина для индукции местного иммунитета в кишечнике — очень важная задача, если учесть, что диарейные заболевания составляют главную причину детской смертности на земном шаре. Еще одно преимущество аттенуированных микроорганизмов как векторов заключается в том, что их могут поглощать макрофаги, вызывая в результате системный иммунный ответ вследствие миграции в другие части тела.

Наибольшее количество векторных вакцин разработано на основе вируса оспы и аттенуированных мутантных штаммов сальмонелл. За рубежом получены рекомбинантные вирусы оспы, способные к экспрессии антигенов вирусов кори, гепатита А и В, японского энцефалита, герпеса простого, бешенства, Эпштейна— Барр, ротавирусов, лепры, туберкулеза. При этом разработанные в США вакцины, предназначенные для профилактики кори, японского энцефалита, папилломатоза человека, геморрагической лихорадки с почечным синдромом (восточный серотип), уже проходят клинические испытания. Несмотря на то что за рубежом в качестве вектора используют штаммы вируса оспы с относительно низкой вирулентностью (NYCBOH, WR), практическое использование подобных рекомбинантных вакцин в значительной степени будет затруднено в связи с давно известными свойствами данного вируса вызывать развитие как неврологических (поствакцинальный энцефалит), так и кожных (вакцинальная экзема, генерализованная вакциния, ауто- и гетероинокуляция).

Что касается сальмонеллезного вектора, то на его основе за рубежом созданы и изучаются препараты столбнячного и дифтерийного анатоксинов, вакцины для профилактики гепатита А, инфекций, вызванных ротавирусами и энтеротоксигенной кишечной палочкой. Естественно, что последние два рекомбинантных препарата в связи с энтеральным введением сальмонелл представляются весьма перспективными.

ДНК-вакцины

Относительно недавно было обнаружено, что для иммунизации можно использовать ДНК как таковую при условии ее внутримышечного введения вместе с подходящим промотором. Подобного рода ДНК-вакцины представляются весьма перспективными, поскольку они обеспечивают развитие напряженного как гуморального, так и клеточного иммунитета. В настоящее время интенсивно разрабатываются вакцины из плазмидных ДНК, кодирующих протективные антигены возбудителей инфекционных болезней. Такая ДНК, введенная животному, проникает в ядро клетки, длительное время существует вне хромосом без репликации, транскрибируется и экспрессирует соответствующие антигены, вызывающие в организме привитого формирование иммунитета. ДНК-вакцины сохраняются в организме 3-4 недели. За это время ДНК-вакцина индуцирует Т- и В-клеточный иммунитет, однако многие механизмы развития иммунного ответа на ДНК-вакцины остаются не изученными.

Для приготовления ДНК-вакцины можно использовать смесь ДНК, которая обеспечивает образование разных антигенов против одной или (теоретически) против нескольких инфекций.

ДНК-вакцины могут быть получены в большом количестве, они стабильны и лишены инфекционных агентов. Перспективным направлением является разработка многокомпонентных вакцин, содержащих две или несколько плазмидных форм, которые кодируют разные антигены, цитокины или другие биологически активные молекулы.

Проблемы безопасности при разработке вакцин из плазмидной ДНК являются наиболее важными.

1. Прежде всего, следует исключить онкогенную опасность. Еще недостаточно изучено, может ли вводимая ДНК встраиваться в геном клетки человека и вызывать мутагенный эффект.

2. Длительная экспрессия антигена может вызывать иммунопатологические реакции. Образование антигена в организме может продолжаться более месяца. Это может привести к развитию различных форм иммуносупрессии и других патологических явлений.

3. Чужеродная ДНК может вызывать образование анти-ДНК-антител, которые в силу перекрестных свойств способны индуцировать различные формы аутоагрессии и иммунопатологии.

4. Сам экспрессированный антиген может обладать побочным биологическим действием.

5. На животных изучены вакцины из ДНК вирусов приобретенного иммунодефицита человека, гриппа, бешенства, лимфоцитарного хориоменингита, гепатитов В и С, простого герпеса, папилломатоза, а также возбудителей малярии, лейшманиоза, туберкулеза. На стадии клинических испытаний находится ДНК-вакцина против малярии, ВИЧ-инфекции, гриппа, гепатита В.

Вакцины на основе трансгенных растений.

С помощью методов генной инженерии представляется возможным "внедрить" чужеродные гены почти во все технические сельскохозяйственные культуры, получив при этом стабильные генетические трансформации. С начала 90-х годов проводятся исследования по изучению возможности использования трансгенных растений для получения рекомбинантных антигенов. Данная технология особенно перспективна для создания оральных вакцин, поскольку в этом случае рекомбинантные белки, образуемые трансгенными растениями, могут действовать непосредственно, вызывая оральную иммунизацию. Естественно, что это происходит в тех случаях, когда растительный продукт используется как пища, не подвергаясь при этом термической обработке. Помимо использования растений как таковых, образуемый ими антиген может извлекаться из растительного сырья.

В первоначальных исследованиях была использована модель: табак -HBsAg. Из листьев трансгенных растений выделен вирусный антиген, по своим иммуногенным свойствам почти не отличающийся от рекомбинантного HBsAg, продуцируемого клетками дрожжей. В дальнейшем получен трансгенный картофель, продуцирующий антиген энтеротоксигенной кишечной палочки и антиген вируса Norwalk. В настоящее время начаты исследования по генетической трансформации бананов и сои.

Подобного рода "растительные вакцины" весьма перспективны:

· во-первых, в ДНК растений может быть встроено до 150 чужеродных генов;

· во-вторых, они, будучи пищевыми продуктами, применяются орально;

· в-третьих, их использование приводит не только к образованию системного гуморального и клеточного иммунитета, но и к развитию местного иммунитета кишечника, так называемого иммунитета слизистых (mucosal immunity). Последний особенно важен при формировании специфической невосприимчивости к кишечным инфекциям.

В настоящее время в США проводится I фаза клинических испытаний вакцины энтеротоксигенной кишечной палочки, представляющей собой лабильный токсин, экспрессированный в картофель.

Дата добавления: 2018-04-04; просмотров: 1465; Мы поможем в написании вашей работы!

Поделиться с друзьями:

Мы поможем в написании ваших работ!