Приготовление и титрование референс-штаммов
(вакцинных штаммов Сэбина) вируса полиомиелита типов 1, 2 и 3
Вакцинные штаммы Сэбина вируса полиомиелита типов 1, 2 и 3 получают в НЦ и используют для приготовления рабочих запасов референс-штаммов.
А. Приготовление рабочих запасов референс-штаммов.
Все процедуры выполняют в БЗУ 2 класса защиты, одновременно работают только с вирусом одного типа. Оптимальным является работа с вирусом каждого типа в отдельные дни.
1. Готовят флакон площадью 25 см2 с культурой клеток НЕр-2 (Cincinnati), сформировавшей сливной здоровый монослой в течение 2-3-х дней. Маркируют флакон.
2. Сливают ростовую среду и ополаскивают клеточный слой ФСБ.
3. Вносят во флакон 0,2 мл вируссодержащей жидкости из пробирки с прототипным референс-штаммом, полученным в НЦ. Оставшееся количество прототипного референс-штамма хранят при минус 200С.
4. Инкубируют культуру при 360С в течение 1 часа, периодически осторожно покачивая флакон для лучшей адсорбции вируса.
5. Добавляют поддерживающую среду (около 10 мл), содержащую 5% сыворотки плодов коровы. Флакон помещают в термостат при 360 С.
6. Культуру просматривают ежедневно. После распространения ЦПЭ на 75-100% клеточного монослоя, флакон трижды замораживают и оттаивают для разрушения клеток.
7. Содержимое флакона переносят в центрифужную пробирку, центрифугируют при 1500g 20 минут. Надосадочную жидкость по 0,5 мл переносят в пробирки, предназначенные для хранения референс-штамма, с этикетками, на которых чётко указаны тип клеток, вирусный штамм, дата приготовления. Приготовленные таким образом лабораторные референс-штаммы хранят при минус 200 С.
|
|
|
8. Определяют титр референс-штамма (пункт Б).
9. Эти запасы вируса могут быть использованы для приготовления нужных объёмов для проведения исследований, для проведения процедуры контроля чувствительности клеточных культур и пр. Не следует пассировать вирус в культуре НЕр-2 более 3-х раз.
Б. Определение титра референс-штаммов.
1. Готовят разведение 10-1 исследуемого вируса: 0,1 мл вируса вносят в пробирку, содержащую 0,9 мл среды.
2. Готовят ряд последовательных разведений от 10-2 до 10-8. В маркированные соответствующим образом пробирки разливают по 9,0 мл среды, в первую вносят 1,0 мл разведения 10-1 исследуемого вируса. Новой пипеткой перемешивают содержимое пробирки, переносят 1,0 мл в следующую, меняют пипетку, вновь перемешивают и переносят 1,0 мл, и т.д.
3. Переносят по 100 мкл разведения вируса из пробирок в лунки рядов А-Н колонок 1-10 панели для микротитрования (рис.1а). Для получения статистически достоверных результатов определения титра референс-штамма
используют разведения 10-5 - 10-8, каждое разведение вносят в 20 лунок.
|
|
|
4. Вносят по 100 мкл поддерживающей среды в лунки колонок А-Н рядов 11-12 для контроля клеток.
5. Готовят суспензию клеток в концентрации 1-2 х 105 клеток/1,0 мл, вносят по 100 мкл во все лунки панели. Заклеивают панель плёнкой и помещают в инкубатор при температуре 360С.
6. Ежедневно микроскопируют панель, наблюдая за появлением ЦПЭ, окончательно учитывают результаты на 5-й - 7-й день. Тест считают действительным при образовании в лунках контроля сполошного монослоя нормальных клеток.
7. Рассчитывают титр вируса по формуле Кербера.
lg ТЦД50 = L – d(S – 0,5), где:
L = lg наименьшего разведения сыворотки в опыте;
d = разница между lg последовательных разведений;
S = сумма пропорций тест-объектов (лунок с культурой клеток), давших положительный результат (ЦПЭ) в каждом разведении.
В данном примере (рис.1б):
lg ТЦД50 = -5 -1(2,1-0,5) = -6,6
Титр вируса = 106,6 ТЦД50/0,1 мл
Приложение 6, рисунок 2
Проведение реакции нейтрализации для определения титра нейтрализующих антител к полиовирусу
1. Готовят панели для микротитрования из расчёта 1 панель на каждый тип вируса, маркируют их, обозначая номер исследуемой сыворотки, тип вируса, дату постановки опыта.
|
|
|
2. Вносят 50 мкл питательной среды во все лунки панели, кроме лунок, предназначенных для контроля культуры клеток (ряды А-Н, колонки 11-12). В эти лунки вносят 100 мкл среды (рис. 2а).
3. Необходимый объем сыворотки, приготовленной для исследования, инактивируют в течение 30 минут при 560 С.
4. Готовят разведение 1:4 каждой исследуемой сыворотки, а также референс-сыворотки в поддерживающей среде с добавлением 2% сыворотки плодов коровы. Необходимо иметь как минимум 600 мкл разведения 1:4 каждой сыворотки.
5. Вносят 50 мкл разведения 1:4 каждой сыворотки в соответствующие лунки колонок 1 и 2 в каждую из трёх панелей (рис. 2а).
6. Используя микропипетку с одноразовым наконечником, аккуратно перемешивают содержимое лунки 2 ряда А, отбирают 50 мкл, переносят в лунку 3, вновь перемешивают, отбирают 50 мкл, переносят в лунку 4 и т.д., включая лунку 10. Из лунки 10, соответствующей разведению 1: 2048 после перемешивания 50 мкл содержимого отбрасывают (рис.2б).
Повторяют вышеописанные процедуры для ряда В, используя новый наконечник. Таким образом получены двукратные разведения от 1:8 до 1:2048 сыворотки 1. Лунки колонки 1 рядов А и В служат для контроля токсичности сыворотки, в них не добавляют вирус.
7. Аналогично вышеописанному готовят последовательные разведения второй исследуемой сыворотки и референс-сыворотки. Таким образом, лунки рядов A-F колонок с 1 по 10 предназначены для исследования сывороток.
|
|
|
При титровании сывороток можно использовать многоканальные микропипетки. Следует убедиться, что они хорошо откалиброваны, наконечники соответствуют типу пипетки, в противном случае возможны значительные ошибки опыта.
8. Готовят суспензию нейтрализуемого полиовируса каждого типа с известным заранее титром в поддерживающей среде в количестве, достаточном для исследования намеченного числа сывороток. Разводят каждый вирус так, чтобы в 50 мкл вируссодержащей жидкости содержалось 100 ТЦД50. Для одной панели необходимо примерно 4,0 мл вируса.
8.1. Пример определения рабочего титра вируса.
При предварительном титровании референс-штаммов на культуре клеток Нер-2 был установлен их титр (конечная точка титрования):
Полиовирус типа 1 - 9,02 lg/мл
Полиовирус типа 2 - 8,44 lg/мл
Полиовирус типа 3 - 8,66 lg/мл
Разведение, которое даёт концентрацию 100 ТЦД50/мл – это в 100 раз меньшее разведение, чем конечная точка титрования. Так как в лунку вносят 50 мкл разведения вируса, то его рабочее разведение должно быть в 20 раз (или на 1,3 lg) меньше. Т.о. рабочее разведение референс-штаммов будет следующим:
Полиовирус типа 1 - 5,72 lg/мл (можно использовать разведение -6)
Полиовирус типа 2 - 5,14 lg/мл (можно использовать разведение -5)
Полиовирус типа 3 - 5,36 lg/мл (можно использовать разведение -5)
8.2. Пример приготовления ряда последовательных разведений референс-штаммов.
| Разведения | Объём среды для разведения | Объём вирусной суспензии |
| 10-1 | 0,9 мл | 0,1 мл |
| 10-2 | 0,9 мл | 0,1 мл |
| 10-3 | 0,9 мл | 0,1 мл |
| 10-4 | 0,9 мл | 0,1 мл |
| 10-5 – рабочее разведение для полиовирусов типов 2 и 3 | 3,6 мл | 0,4 мл |
| 10-6 – рабочее разведение для полиовируса типа 1 | 3,6 мл | 0,4 мл |
| 10-7 | 0,9 мл | 0,1 мл |
| 10-8 | 0,9 мл | 0,1 мл |
9. Вносят 50 мкл рабочего разведения вируса определённого типа в лунки рядов А2-А10 – F2-F10 соответствующей типу вируса панели. В лунки колонок 1, 11, 12 , а также рядов G и H вирус не добавляют (рис. 2в).
Ряды G и H предназначены для титрования референс-вируса для контроля рабочей дозы. Вносят 50 мкл последовательных разведений вируса, начиная с наибольшего (от – 9 до – 5 ).
10. Панели заклеивают специальной пластиковой плёнкой, закрывают крышкой, крайне осторожно постукивают пальцем по краю панели для лучшего смешивания ингредиентов в лунках и помещают на 3 часа в термостат при температуре 360С.
11. Готовят суспензию клеток Нер-2 в ростовой среде в концентрации 1-2 х 104 клеток в 100 мкл.
12. Добавляют по 100 мкл клеточной суспензии во все лунки всех панелей. Заклеивают панели, помещают в термостат при температуре 360С на 5 дней. Учёт результатов начинают на 3-й день, окончательный учёт – на 5-й день.
При учёте результатов обращают внимание на состояние контролей культуры, токсичность сыворотки, результаты контрольного титрования рабочих разведений референс-вирусов. Для контроля рабочей дозы каждого из использованных в опыте вирусов по формуле Кербера рассчитывают титр вируса (см. Приложение 5). Если рабочая доза выходит за пределы 50-200 ТЦД50, результаты опыта не считают достоверными.
При учёте результатов обращают внимание на воспроизводимость уже известных титров референс-сыворотки. Если в опыте значения титров резко отличаются от ожидаемых, результаты опыта считают недействительными.
13. Рассчитывают конечную точку нейтрализации по формуле Кербера.
Логарифм 50% нейтрализующего титра = L – d(S – 0,5), где:
L = lоg наименьшего разведения сыворотки в опыте,
d = разница между lоg последовательных разведений,
S = сумма пропорций тест-объектов (лунок с культурой клеток), давших положительный результат (ЦПЭ) во всех испытанных разведениях сыворотки. Переводят разведения сыворотки в логарифмические значения (разведение 1:4 = 2, 1:8 = 3, 1:16 = 4 и т.д.). Титром антител в сыворотке считается её наибольшее разведение, защищающее 50% тест-культур от действия 100 ТЦД50 вируса. Титр вируса часто выражают величиной, обратной разведению (т.е. при разведении 1:256 титр антител выражается как 256)
13.1. Пример расчёта титра сыворотки (рис 2г, сыворотка 1).
_____________________________________________________________
Разведение сыворотки (lоg) Пропорции тест объектов
1:8 3 0/2 = 0
1:16 4 0/2 = 0
1:32 5 0/2 = 0
1:64 6 1/2 = 0,5
1:128 7 2/2 = 1
1:256 8 2/2 = 1
1:512 9 2/2 = 1
1:1024 10 2/2 = 1
1:2048 11 2/2 = 1
_____________________________________________________________
S = 5,5
lg ТЦД50 = L – d(S – 0,5) = 11 – 1(5,5 – 0,5) = 6 (1:64)
Приложение 7
Список лабораторий Российской Федерации, осуществляющих вирусологические исследования материалов от больных полиомиелитом, с подозрением на это заболевание, с синдромом острого вялого паралича.
| Лаборатория | Адрес | Телефон | Факс | Электронный адрес | |
| 1 | Национальный центр по лабораторной диагностике полиомиелита (ГУ Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П. Чумакова РАМН) | 142782, Московская обл., п/о Института полиомиелита | (495) 439 90 54 | (495) 439 93 21 (495) 549 67 60 | poliom@aha.ru |
| 2 | Региональный центр эпидемиологического надзора за ПОЛИО/ОВП (ФГУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии в г. Москве», Роспотребнадзора) | 129626, г. Москва, Графский переулок, 4/9 | (495) 687 36 16 | (495) 687 40 39 | poliolab@mossanepid.ru |
| 3 | Региональный центр эпидемиологического надзора за ПОЛИО/ОВП (ФГУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии в Омской области», Роспотребнадзора) | 644116, г.Омск, 27-я Северная, 42а | (3812) 68 08 37 | (3812) 68 08 37 | polioom@mail.ru |
| 4 | Региональный центр эпидемиологического надзора за ПОЛИО/ОВП (ФГУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии в Свердловской области»,Роспотребнадзора) | 620219, г. Екатеринбург, Отдельный пер., 3 | (343) 374 35 96 | (343) 374 47 03 | polioekb@ocsen.utk.ru |
| 5 | Региональный центр эпидемиологического надзора за ПОЛИО/ОВП (ФГУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии в Ставропольском крае» Роспотребнадзора) | 355008, г. Ставрополь, ул.Фадеева, 4 | (865) 294 65 93 | (865) 294 68 54 | poliost@avn.skiftel.ru |
| 6 | Региональный центр эпидемиологического надзора за ПОЛИО/ОВП («Центр гигиены и эпидемиологии в Хабаровском крае» Роспотребнадзора) | 680009, г.Хабаровск, ул.К.Маркса, 109б | (421) 227 47 72 | (421) 227 47 81 | poliokhv@mail.redcom.ru |
| 7 | Региональный центр эпидемиологического надзора за ПОЛИО/ОВП (ФГУН НИИЭМ им.Пастера, г.Санкт-Петербург, Роспотребнадзора) | 197101, г.Санкт-Петербург, ул. Мира, 14 | (812) 233 21 56 | (812) 232 92 17 | poliospb@nr3854.spb.edu |
Дата добавления: 2018-02-28; просмотров: 651; Мы поможем в написании вашей работы! |
Мы поможем в написании ваших работ!