ПЦР в реальном времени с реакцией обратной
Метод был изобретен для детекции количества ДНК в пробе, однако, последнее время все чаще используется немного видоизмененный количественный ПЦР для детекции РНК. Метод носит название ПЦР в реальном времени с реакцией обратной транскрипции (ОТ-кПЦР, RT-qPCR). Этот метод широко используется для характеризации или сравнения уровней мРНК в разных популяциях[5].
Прежде, чем проводить стандартный ПЦР в реальном времени, нужно провести реакцию обратной транскрипции, для синтеза кДНК. Реакция обратной транскрипции проводится с помощью фермента — обратной-транскриптазы (РНК-зависимой ДНК полимеразы, ревертазы). Реакцию можно проводить без добавления праймера, однако наибольшая эффективность достигается, когда праймер добавлен. Существует три основных типа праймеров:
1. Олиго dT праймеры — гибридизуются с polyA последовательностью, которая есть на 3’ -конце многих эукариотических мРНК.
2. Случайная последовательность. Обычно используют либо гексамеры, либо нонамеры. Такие последовательности могут транскрибировать все мРНК
3. Ген-специфичные праймеры используются, когда исследуется мРНК, экспрессируемая с определенного гена[4].
Реакция обратной транскрипции — ключевой этап в данном подходе, так как количество кДНК должно соответствовать количеству изучаемой мРНК. РНК-молекула менее стабильна, чем ДНК, поэтому при выделении РНК и проведении ОТ-кПЦР нужно тщательно следить за чистотой процедур и не допускать попадания большого количества РНКаз.
Дата добавления: 2015-12-21; просмотров: 22; Мы поможем в написании вашей работы! |
Мы поможем в написании ваших работ!