Алгоритм выявления БРС-КВ с помощью рвОТ-ПЦР и секвенирования
Лабораторные исследования ближневосточного респираторного синдрома Коронавируса
Межсессионные рекомендации
Сентябрь 2013
Введение
Целью данного документа является предоставление лабораториям и вовлеченным в процесс лабораторных исследований посредникам межсессионных рекомендаций по ближневосточному респираторному синдрому Коронавируса (БРС-КВ). Всемирная организация здравоохранения регулярно публикует обновляемые сведения о текущем положении заболеваемости БРС-КВ на: http://www.who.int/csr/disease/coronavirus_infections/en/
Рекомендации, подготовленные ВОЗ, основаны на текущих знаниях. Они были пересмотрены лабораторными экспертами, включая специалистов, которые имеют опыт обращения с данным вирусом и другими коронавирусами, и квалифицированных специалистов в области диагностических проб на коронавирусы. ВОЗ тщательно отслеживает исследования, относящиеся к этому вирусу, и пересмотрит данные ею рекомендации, если это будет необходимо. В случае если нововведения не появятся, срок действия данного документа истечет 28 февраля 2014г.
Показания для обследования
ВОЗ рекомендует, чтобы практикующие врачи, врачи-эпидемиологи и лабораторные научные работники для выявления заболевания следовали схеме опроса, разработанной ВОЗ и опубликованной здесь: http://www.who.int/csr/disease/coronavirus_infections/case_definition/en/index.html, которая будет при необходимости обновляться.
|
|
|
Тестирование на другие патогенные заболевания, используя лабораторные процедуры, как это установлено руководствами местного уровня по приобретенной пневмонии, должны проводиться в рабочем порядке, но не задерживая при этом тестирование на БРС-КВ. Примеры другой этиологии болезни, включают: пневмококк, ХИБ-инфекция, легионелла пневмобилия, вирусы гриппа и синцитиальный респираторный вирус человека.
Хранение и транспортировка проб
Когда бы ни были взяты пробы для исследования, необходимо следовать руководству по инфекционному контролю. ВОЗразработано специальное руководство, которое доступно по следующей ссылке:
http://www.who.int/csr/disease/coronavirus_infections/IPCnCoVguidance_06May13.pdf
Забор проб лучше производить из нижних дыхательных путей, где находятся содержащие наивысшие концентрации вируса материалы, такие как бронхоальвеолярные выделения, мокротные и трохейные материалы. Недавние сообщения о случаях заболеваемости инфекцией БРС-КВ в Саудовской Аравии (3) подтвердили также важность при выявления вируса забора проб из верхних дыхательных путей, таких как мазки из носо- и ротоглотки. При возможности, необходимо забирать пробы как из верхних, так и из нижних дыхательных путей.
|
|
|
Для того чтобы увеличить вероятность обнаружения вируса, в течение курса лечения необходимо забирать множество проб с различных участков тела пациента. Даже после первичного обнаружения вируса настоятельно рекомендуется продолжать забор проб и их исследование, так как это позволит улучшить знания в области продолжительности бессимптомного вирусовыделения. Вирус обнаружен в моче и кале, но на предыдущем уровне он был найден в нижних дыхательных путях (1). На сегодняшний день, существует мало информации о значении цельной крови при заборе проб для выявления БРС-КВ.
Необходимо забирать сыворотку крови. Парные пробы более предпочтительны, однако одинарная проба тоже ценна. Забор сыворотки для парных проб должен производиться спустя 14-21 день, при условии, что первая проба была взята в течение первой недели заболевания. Если возможна только одинарная проба, она должна быть произведена минимум через 14 дней после появления симптомов.
В Таблице 1 перечислены виды проб, которые могут быть взяты, а также нормы по их хранению транспортировке.
Пробы должны быть доставлены в лабораторию как можно быстрее. Важность надлежащего обращения при транспортировке не может быть переоценена. Если существует вероятность задержек при доставке проб в лабораторию, настоятельно рекомендуется пробы заморозить, предпочтительно при - 80 0С, и транспортировать на сухом льду. Однако важно избегать повторного замораживания и размораживания проб. Сыворотка должна быть выделена из цельной крови и может храниться при 4°C,а также может быть заморожена до -20°C и ниже и транспортироваться на сухом льду. Необходимо избегать хранения респираторных и сывороточных проб в домашних морозильных камерах без образования наледи, в связи с сильными температурными колебаниями в них.
|
|
|
Перевозка проб в пределах государственных границ должна отвечать действующим федеральным нормативам.
Международная транспортировка проб БРС-КВ должна отвечать международным нормативам, как описано в «Руководстве ВОЗ по транспортировке патогенных материалов 2013-2014», доступном по ссылке: http://www.who.int/ihr/publications/who_hse_ihr_20100801/en/index.html
| Тип материала | Определенная среда при транспортировке | Транспортировка до лаборатории | Категория при перевозке опасных материалов |
| Сыворотка | нет | 4°C* Если период после взятия пробы > 48 часов, необходима заморозка и транспортировка на сухом льду | Биологические препараты, Категория Б |
| бронхоальвеолярные выделения | нет | аналогично | аналогично |
| трохейные аспираты | нет | аналогично | аналогично |
| Аспираты из носоглотки | нет | аналогично | аналогично |
| Комбинированные мазки из носо- и ротоглотки | Вирусная транспортная среда | аналогично | аналогично |
| Ткани, полученные при биопсии или аутопсии, включая ткани легких | Вирусная транспортная среда или стерильный физиологический раствор, если проба на бактериальные культуры | аналогично | аналогично |
| Сыворотка для серологического исследования: Парные пробы с первым забором предпочтительно в первую неделю болезни и вторым забором двумя-тремя неделями позже. Одинарная проба должна быть взята минимум через 14 дней после проявления симптомов. | нет | 4°C* или заморозить и перевозить на сухом льду | аналогично |
*- С использованием водного льда или путем холодного обертывания, по обстоятельствам.
|
|
|
Алгоритм выявления БРС-КВ с помощью рвОТ-ПЦР и секвенирования
Порядок подтверждения случаев инфекции БРС-КВ основан на выявлении уникальных цепочек вирусной РНК путем осуществления в режиме реального времени полимеразной цепной реакции с обратной транскриптацией (рвОТ ПЦР) с подтверждением с помощью секвенирования нуклеиновой кислоты, если это необходимо. Ниже приведены результаты серологического исследования БРС-КВ.
При определенных условиях, но не в случае рутинной диагностики, лаборатории с соответствующим опытом и системами сдерживания распространения инфекции могут предпринять попытку выделить вирус из клетки. Процедуры по выделению вируса не подпадают под текущую редакцию предлагаемых рекомендаций.
При наличии данного вируса все исследования должны проводиться в соответствующим образом оборудованных лабораториях персоналом, обученным правилам техники безопасности. Межсессионные рекомендации ВОЗ по системе управления лабораторными био рисками при работе с БРС-КВ опубликованы по ссылке:
http://www.who.int/csr/disease/coronavirus_infections/NovelCoronavirus_InterimRecommendationsLaboratoryBiorisk_190213/en/index.html.
Отдельные страны-члены ВОЗ будут решать, какая из лабораторий, если таковые имеются, будут проводить данные исследования.
Было разработано три метода рвОТ-ПЦР для рутинного выявления БРС-КВ, а их детали были опубликованы. Это следующие методы: исследование, нацеленное на изменение гена Е протеина (upЕ) (4), и исследования, направленное на открытую рамку считывания 1б (ОРС 1б) (4) и открытую рамку считывания 1а (ОРС 1 a) (5).
Исследование upЕ считается высокочувствительным и, поэтому, является рекомендуемым при скрининге, также как и ОРС 1а исследование, которое обладает той же чувствительностью. ОРС 1б исследование считается менее чувствительным по отношению к ОРС 1а. Источники (4) и (5) содержат подробные описания по осуществлению данных исследований.
Кроме того, в Центрах по Контролю и Профилактике Заболеваний США (ЦКПЗ) было разработано тестирование рвОТ-ПЦР, направленное на БРС-КВ нуклеокапсид (Н) белкового гена, которое может служить дополнением к upЕ и ОРС 1а исследованиям для скрининга и подтверждения.
Было установлено 2 участка генома нового коронавируса, подходящих для сиквенирования для более точного подтверждения диагноза. Они находятся в РНК - зависимой РНК полимеразе (РзРп) и в (Н) генах (5).
Дальнейшее описание данных исследований доступны на сайте Институса Вирусологии, Бонн, Германия: http://www.virology-bonn.de/index.php?id=40
Дальнейшую информацию о данных исследованиях, сформулированную американскими ЦКПЗ, можно получить у Декана Д. Ердмана (dde1@cdc.gov).
Рисунок 1 показывает алгоритм проведения исследования при подозрение на случай заболеваемости БРС-КВ с помощью рвОТ ПЦР.
Рисунок 1. Алгоритм проведения исследования на БРС-КВ методом рвОТ-ПЦР
 | ||||
| ||||
 | |||
| |||
Результаты исследования на БРС-КВ лабораторий с ограниченным опытом в данных исследованиях должны подтверждаться лабораториями с большим опытом обработки образцов, содержащих этот вирус. ВОЗ может оказывать помощь государствам - членам в поиске лабораторий, способных предоставить такую услугу. Кроме того, лаборатории, возможно, будут заинтересованы в перепроверке своих положительных результатов методом повторного извлечения нуклеиновой кислоты и повторного тестирования образцов.
При противоречии двух анализов рвОТ-ПЦР, направленных на уникальное местоположение в геноме БРС-КВ, необходимо проведение секвенирование ампликона полученного из соответствующего ОТ-ПЦР анализа.
Эти данные секвенирования, в дополнении к подтверждению присутствия вируса, могут также дать ценную информацию, которая может помочь в понимании происхождения вируса и способов его распространения. Поэтому рекомендуется секвенировать максимально возможное количество нуклеиновых кислот БРС-КВ из положительных образцов.
Известны случаи четырех коронавирусов человека с поражением дыхательных путей легкой и средней тяжести. Это бэта-коронавирусы hCoV-OC43 и hCoV-HKU1, и альфа-коронавирусы hCoV-229E и hCoV-NL63. Коммерческий многоканальный тест ПЦР для респираторных возбудителей в состоянии определить эти вирусы. Важно положительные результаты данных тестов ошибочно не связать с БРС-КВ.
Серия отрицательных результатов не должна полностью исключать вероятность инфицирования. Ниже описан ряд факторов, которые могут привести к ложно - отрицательным результатам:
- низкое качество образца.
- образец был взят либо слишком поздно, либо слишком рано.
- образец был взят и транспортирован не должным образом.
-технические причины, возникающие при тестировании, например, мутация ПЦР ингибирования.
Если получен отрицательный результат у пациентов с высоким индексом подозрения на заражение коронавирусом, то необходимо взять и проверить дополнительные образцы. Лаборатории так же могут рассмотреть вопрос о направлении одного или более отрицательных образцов в зарубежные лаборатории для подтверждения результатов.
Чтобы считать случай лабораторно подтвержденным, должно быть выполнено одно из следующих условий:
- положительный результат ПЦР как минимум для двух разных клеток в геноме БРС-КВ
или
- один положительный результат ПЦР для конкретной клетки в геноме БРС-КВ и дополнительный секвенированный другой ПЦР продукт, подтверждающий принадлежность к известной последовательности БРС-КВ.
Случай положительного результата ПЦР для одной конкретной клетки без дальнейшего тестирования, но с динамикой потенциального воздействия и последовательных клинических признаков, считается вероятным случаем.
Дата добавления: 2022-12-03; просмотров: 15; Мы поможем в написании вашей работы! |
Мы поможем в написании ваших работ!