Каждая подгруппа готовит один из вариантов ферментационной среды согласно расчёту.
ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 1
Исследование периодического метода культивирования.
Влияние состава питательных сред на рост микроорганизмов
ЦЕЛЬ РАБОТЫ: Изучить технологию приготовления жидких питательных сред, ведения посева и культивирования микроорганизмов в глубинной культуре в лабораторных условиях.
ПРОГРАММА теоретической РАБОТЫ (вопросы для коллоквиума):
1. Изучить основные сведения о сырье и питательных субстратах, используемых для приготовления питательных сред.
2. Изучить влияние компонентов питательных сред на рост и развитие микроорганизмов.
3. Изучить основные сведения о классификации питательных сред, технологии их приготовления и стерилизации.
4. Ознакомиться с составом жидкой питательной среды для ферментации.
5. Ознакомиться с основными сведениями о процессе глубинной ферментации микроорганизмов и факторами, влияющими на этот процесс.
6. Высшие плесневые грибы (систематика, морфологические, культуральные, физиологические, биохимические свойства).
7. Получение лимонной кислоты поверхностным (жидкофазным и твердофазным методом), глубинным методом.
8. Механизм биосинтеза. Гликолиз, Цикл Кребса.
9. Активаторы и ингибиторы процесса.
2. ПРОГРАММА практической РАБОТЫ:
1. Рассчитать необходимые количества компонентов для приготовления ферментационной среды.
2. Сделать их навески.
3. Приготовить ферментационную среду.
|
|
|
4. Простерилизовать приготовленную питательную среду.
5. Провести в стерильных условиях посев микроорганизма-продуцента в жидкую питательную среду.
6. Осуществить процесс глубинной ферментации.
7. Провести описание характера развития продуцента.
8. Оформить результаты.
3. ОСНОВНЫЕ СВЕДЕНИЯ
Микроорганизмам для развития и размножения необходимы все элементы, входящие в состав микробной клетки: углерод, водород, азот, фосфор, сера, калий, кальций, магний, железо и микроэлементы. Микроорганизмы также должны быть обеспечены источником энергии для осуществления клеточных синтезов. Эти потребности клетки удовлетворяются за счет источников питания. Для приготовления питательных сред в микробиологической промышленности используют сырье: минеральное, животного и растительного происхождения, а также синтезированное химическим путем. Сырье не должно содержать вредных примесей. Все виды сырья должны соответствовать требованиям ГОСТа. Сложные природные вещества или промышленные побочные продукты должны пройти строгую биохимическую проверку на пригодность в качестве сырья для приготовления питательных сред. При выборе сырья необходимо учитывать его влияние на себестоимость, т.к. в микробиологическом синтезе важное значение имеет стоимость исходных веществ и материалов.
|
|
|
Наибольшее биогенное значение для любого живого организма имеет углерод. Он входит в состав всех органических молекул, образующихся в клетке и на его долю приходится в среднем 50 % клеточного вещества. По этой причине источники углерода занимают основное место среди компонентов питательных сред. Продуценты БАВ по своему отношению к источникам углерода являются гетеротрофами, которые в качестве углеродного питания используют углеводы, служащие источником пластического материала и источником энергии. В промышленности микробного синтеза широко используются чистые углеводы, а также природные и технические продукты, богатые углеводами. К ним относятся глюкоза, сахароза, лактоза, крахмал, кукурузная мука, меласса, зеленая патока.
Для приготовления питательных сред для получения вторичных метаболитов используется техническая кристаллическая глюкоза (ГОСТ 975-63) – С6Н12О6. Содержание основных веществ: вода – не более 9%, золы – не более 0,07% (в том числе не более 0,004% Fe), редуцирующих веществ – не менее 99,5% (в пересчете на сухой остаток), т.е. она фактически представляет собой чистый углевод.
|
|
|
Сахароза (С12Н22О11) — свекловичный или тростниковый сахар. Техническая сахароза, используемая в промышленности, содержит не менее 99,75 % сахарозы, золы – не более 0,03%, влаги – 0,15%. Сахароза представляет собой дисахарид, состоящий из глюкозы и фруктозы.
Лактоза — молочный сахар. Она содержится только в молоке и в других природных продуктах не обнаружена. Получают лактозу из молочной сыворотки, которая образуется при производстве сыров, творогов, казеина. Сыворотку освобождают от белков, упаривают до получения сиропа (используют для пр-ва пенициллина). Лактоза-сырец содержит: 92% сахара, не более 3% воды, 2% золы и 1% молочной кислоты, белков не более 2%. Лактоза представляет собой дисахарид, состоящий из глюкозы и галактозы.
Крахмал на 96 - 97 % состоит из полисахаридов, кроме того, в нем присутствуют минеральные вещества 0,2-0,7% (в основном Р) и жирные кислоты 0,6% (пальмитиновая и стеариновая). Полисахариды крахмала представлены двумя типами — амилозой (10 - 20 %) и амилопектином (80 - 90 %). Цепи амилозы состоят из остатков D-глюкозы, соединенных α-гликозидными связями между 1 и 4 углеродными атомами: Амилопектин тоже представляет собой полимер глюкозы, но его молекула разветвлена, благодаря наличию связей между 1 и 6 углеродными атомами. В среднем на 25 атомов глюкозы приходится одна связь 1-6.
|
|
|
Крахмал получают из картофеля или кукурузы. Крахмалы разного происхождения значительно различаются по разветвленности цепей, степени полимеризации и некоторым другим свойствам. Под действием амилолитических ферментов крахмал расщепляется до глюкозы, которая в дальнейшем утилизируется продуцентом по гликолитическому или пентозофосфатному путям.
Кукурузную муку получают при размалывании зерен кукурузы. В промышленных средах кукурузная мука часто заменяет крахмал, являясь более дешевым сырьем. Кукурузная мука содержит: крахмал б7 - 70 %; другие углеводы (клетчатка, декстрины, пентозаны, растворимые yrлеводы) - 10 %; белки - 12 % (30% глютелина, 45-50% казеина); зола - 0,9 %, влажность – не более 15%. Среди зольных элементов в наибольшем количестве присутствуют ионы фосфора (до 45% P2O5), калия (30% K2O), магния (15% MgO). Состав кукурузной муки может колебаться в значительных пределах в зависимости от сорта кукурузы, условий ее выращивания и хранения. Кукурузная мука – источник С в питательных средах для пр-ва антибиотиков и ферментов, это самый дешевый продукт из всех зерновых и ее цена зависит от степени измельчения.
Меласса — отход сахарного производства. Она представляет собой маточный раствор, образующийся при отделении кристаллов сахарозы на центрифуге после третьей кристаллизации. По внешнему виду меласса – густая вязкая жидкость темно-коричневого цвета. Состав мелассы непостоянен и может колебаться в значительных пределах в зависимости почвенных и климатических условий выращивания свеклы, технологии ее переработки, условий транспортировки и хранения мелассы. Нормальная меласса в среднем содержит: 18-25% воды, сахароза - 45 - 50 %, общий азот - 1,2 - 2,2 %, зола - 6 - 10 %. В мелассной золе присутствует много азотнокислых, сернокислых, хлористых, углекислых солей калия, натрия, магния, железа, аммония, но сравнительно мало Р, Al, Cu. Кроме того, в мелассе содержится ряд аминокислот, витаминов группы В, биотин и органических кислот (муравьиная, щавелевая, янтарная, уксусная и пировиноградная), меланины (продукты конденсации сахаров и аминокислот), азотистые основания.
Зеленая патока – отход производства глюкозы из крахмала. Она содержит не менее 76 % редуцирующих веществ (в пересчете на сухой остаток), золы - не более 3,5 %, сухих веществ - не менее 50 %. Сахара зеленой патоки состоят в основном из глюкозы. Основная часть зольных элементов — хлористый натрий, образующийся при нейтрализации соляной кислоты, применяемой для гидролиза крахмала содой. Азотное питание микроорганизмов по своему значению приближается к углеродному, хотя уступает последнему по объему.
Гидрол – маточник при кристаллизации глюкозы (рН~4), вырабатываемой из кукурузного зерна (отход крахмало-паточного пр-ва). Глюкозы – 20-50%, 18% несбраживаемых сахаров (продукты неполного расщепления крахмала и вторичной полимеризации глюкозы), некоторое кол-во органических кислот, не более 7% золы (основа – NaCl, образующийся при нейтрализации содой HCl, применяемой для гидролиза крахмала, Р, Mg, Fe). Это густой темный сироп с характерным запахом. Он – нестандартное сырье и должен проверяться в контрольных ферментациях.
Источники С для пр-ва кормовых белков и ферментов:
В производстве кормовых белков, ферментов для сельского хозяйства применяется более дешевое сырье.
Мелассная барда – отход спиртового пр-ва. Содержание сухих в-в: 6-10% (дрожжевая масса, аминокислоты, гликолевая, молочная, янтарная кислоты, соли кальция, калия, натрия, марганца, кобальта, меди и ряд витаминов группы В.
Ацетонобутиловая барда – отход микробиологического пр-ва ацетона и бутилового спирта. Состав: углеводы, клетчатка, азотсодержащие и зольные в-ва.
Древесное сырье (для пр-ва ферментативных препаратов) – многолетние растительные ткани, содержащие целлюлозу, лигнин, пентозаны, гемицеллюлозы и другие в-ва, образующие клеточный матрикс растительной ткани. В этом сырье в свободном состоянии гексозы, пентозы и органические кислоты не встречаются, поэтому его подвергают измельчению и гидролизу при высоких температурах в гидролиз-аппаратах. Используют отходы переработки древесины – горбыль, щепа, опилки и др. Гидролизат – раствор, получаемый при гидролизе древесины, оценивают по содержанию моносахаридов (зависит от породы древесины, способа гидролиза и др.). Для получения кормовых дрожжей используют отходы целлюлозного пр-ва – сульфитный щелок и предгидролизаты. Сульфитный щелок образуется в процессе варки древесины в среде гидросульфита кальция и сернистой кислоты. Целлюлоза при этом сохраняется, а в раствор переходят лигнин, гемицеллюлозы, смолы, жиры, минеральные соли. Используют для микробиологического пр-ва этилового спирта и кормовых дрожжей. Предгидролизаты образуются при водном или кислотном гидролизе гемицеллюлоз древесины и состоят из пентозного сахара и декстринов.
Растительные целлюлозосодержащие с/х отходы (хлопковая и рисовая шелуха, кукурузные кочерыжки, подсолнечная лузга, солома) и некоторые растения (камыш, стебли хлопчатника и др.). Подготовка сырья – гидролиз целлюлозы до растворимых сахаров. Ценность – возобновляемое сырье.
Торф – по химсоставу близок к растениям, из которых он образовался. В торфе малой степени разложения – до 50% полисахаридов. Гидролиз торфа дает легкоусвояемые м/о моносахариды, содержит азот и фосфор в доступной для м/о форме.
Углеводороды. Для получения кормовых дрожжей используют предельные углеводороды нормального строения – н-парафины («жидкие» С10 – С27), выделяют из соответствующих фракций нефти (температура кипения 280-320°С). М/о могут усваивать газообразные предельные углеводороды С1 – С4 (метан, этан, пропан и бутан).
Метиловый спирт. Легко усваивается м/о. Получают из природного газа, нефти и каменного угля. Перспектива его использования зависит от эффективности способа его получения. Для человека – яд.
Этиловый спирт – перспективное сырье. Растворим в воде, нетоксичен, получаемая на нем биомасса не требует очистки. Допускается присутствие изопропилового спирта, серусодержащих соединений, органических кислот, сложных эфиров, диэтилового эфира, нерастворимых в воде в-в.
Уксусная кислота (60%-ная, формальдегида и муравьиной кислоты – не более 1%). Основной источник углерода в пр-ве L-лизина.
Азот входит в состав клеточных компонентов, которые обеспечивают жизнеспособность организмов. Источниками азотного питания для продуцентов БАВ служат различные азотсодержащие вещества неорганического и органического происхождения.
В производственных питательных средах источниками азота могут служить белки, пептиды, свободные аминокислоты. Чаще всего в промышленной ферментации используют кукурузный экстракт, соевую муку или гидролизаты дрожжей. Из минеральных источников чаще используют аммониевые соли серной, соляной или азотной кислот.
Влияние источников N на биосинтез зависит не только от самого источника, но и от общего состава среды. Существенное значение имеет соотношение азота и углерода в среде – определенное для каждого штамма-продуцента.
Кукурузный экстракт - это отход производства крахмала из кукурузы. По внешнему виду это густая жидкость от светло-желтого до темно-коричневого цвета с хлопьевидной взвесью или почти однородная. Химический состав зависит от сорта кукурузы, условий выращивания, хранения и сушки, условий процесса замачивания и колеблется в широких пределах. В состав кукурузного экстракта входят (в процентах): сухие в-ва – не более 48, общее содержание азотсодержащих в-в в пересчете на сухой экстракт – 40-50 (азот общий - 6 – 8); азот аминный - 1 - 3; в процессе замачивания происходит ферментативный гидролиз белков кукурузы, поэтому около половины азотсодержащих в-в экстракта – это смесь аминокислот, пептидов и белков (азот белковый - 0,8 – 2); углеводы - 0 - 10; органические кислоты - 15 - 20; зола - не более 24. Основными элементами золы являются фосфор (до 5%) , калий, магний. Часть фосфора находится в органически связанном состоянии в виде фитина (инозитгексафосфорная кислота С6Н6[ОРО(ОН)2]6). Кукурузный экстракт также содержит витамины группы В, биотин, некоторые ростовые вещества, биостимуляторы. Ценность кукурузного экстракта определяется наличием хорошо ассимилируемых источников органического азота, углерода и микроэлементов и отсутствием балластных в-в.
Соевую муку получают при размальвании соевых бобов, а также соевого жмыха и шрота, образующихся после извлечения соевого масла. В зависимости от используемого сырья соевая мука подразделяется на необезжиренную, полуобезжиренную и обезжиренную. Кроме того, соевая мука бывает дезодорированная (обработанная паром) и недезодорированная. Обработка паром позволяет увеличить срок хранения, и дезодорированная мука может храниться в течение года (т.к. инактивируются ферменты), а недезодорированная - 1,5 - 3 месяца. Из основных компонентов соевой муки особое значение для процессов ферментации имеют азотсодержащие вещества. Азот соевой муки находится главным образом в составе белков, на долю которых приходится 40,5 %. Основной белок соевой муки – глицинин, который содержит почти все аминокислоты (~ 20% глутаминовой к-ты). Кроме белков в соевой муке содержатся углеводы - до 25 % (поэтому часто используется как источник углерода); органические кислоты - 1,5 %; зола - 4,5 - 6,5 % (45% оксида калия, 30% фосфорного ангидрида и 7% оксидов магния и кальция, также ряд микроэлементов). Фосфор находится в органически связанном состоянии в виде фитина (около 75%). В необезжиренной муке присутствует 19,5 % жира.
Неорганические источники N. Нитрат аммония (аммиачная селитра) NH4NO3 – бесцветные кристаллы, хорошо растворимые в воде с поглощением теплоты. Водные растворы имеют кислую реакцию, поэтому также используют для подкисления среды. Сульфат аммония (NH4)2SO4 хорошо растворяется в воде с поглощением теплоты. Содержание азота 20-21%. Карбамид (мочевина) CO(NH2)2 – высококонцентрированный источник азота (46,5% азота). Следует учитывать, что он при термической обработке разрушается. Аммиачная вода (гидроксид аммония) NH4OH – бесцветная жидкость с резким запахом, легко испаряется, ядовита. Также используется как регулятор рН среды. Аммиачная вода I сорта содержит не менее 25%, а II сорта не менее 20% азота.
Минеральные компоненты играют важную роль в жизнедеятельности микроорганизмов. Содержание их в клетке относительно невелико, но функции чрезвычайно важны. Минеральные элементы в клетках микроорганизмов необходимы для регулирования осмотического давления, окислительно-восстановительных условий и величины рН. Они изменяют гидрофильность протоплазмы, а также играют и пластическую роль, входя в состав конструктивного материала клеток. Минеральные элементы участвуют в формировании пространственной структуры биополимеров – белков и нуклеиновых кислот.
Одна из основных функций минеральных элементов – участие в ферментативном катализе. В настоящее время действие четвертой части всех ферментов в клетке связано с металлами. Минеральный состав питательной среды формирует распределение электрических зарядов на поверхности клетки. Обычно клетки микроорганизмов имеют отрицательный заряд. При добавлении в среду электролитов он снижается и тем сильнее, чем выше валентность добавляемого противоиона. Изменение электрического потенциала клеток может изменить их физиологическую деятельность, воздействовать на селективность клеточной мембраны, вызвать флокуляцию или флотацию клеток.
Наибольшее влияние на рост и развитие оказывают ионы Fe, Cu, Mn, Zn, В, Mo, Co и др. М\о нуждаются в микродозах этих элементов, а повышенные концентрации оказывают ингибирующее действие на рост и размножение. Минеральные элементы вносят с компонентами среды, в которых они находятся в виде примесей, часто неучтенное кол-во. Наиболее важными макроэлементами являются фосфор и сера.
Фосфор. Очень важный элемент среды, т.к. обеспечивает нормальное течение энергетического обмена в клетке, а также главнейших биосинтетических процессов (синтез белков и нуклеиновых кислот, гликолиз). От концентрации фосфора в среде зависит скорость роста культуры и содержание фосфора в клетках м/о.
Источники фосфора:
Аммофос – фосфаты аммония, которые получают нейтрализацией фосфорной кислоты аммиаком:
Чаще применяют аммофос в виде смеси моно- и диаммонийфомфатов, а также нерастворимых примесей (шлама – 6-7% к массе сухого в-ва, в состав него входят фосфаты железа, гипс и др.). Содержание водорастворимого фосфорного ангидрида P2O5 в зависимости от сорта аммофоса достигает 36-48%. Перед внесением в среду аммофос фильтруют, также он является источником и азота.
Ортофосфорная кислота – используется как источник фосфора и для подкисления среды. Содержание P2O5 – 50,7%. Фосфорная кислота играет роль буфера или регулятора концентрации водородных ионов в среде, что важно при использовании сред с низкой буферной емкостью (гидролизаты).
Сера. Играет большую роль в структуре клеток, входит в состав серусодержащих аминокислот, двух витаминов (биотин, тиамин) и КоА.
Источник серы в среде – неорганические сульфаты. В молекулу сера включается в восстановленном состоянии и, следовательно, проходит ряд превращений:
SO4 2- ® SO3 2- ® SO2 2- ® S2O3 2- ® SH-
Тиосульфат (Na2S2O3) – наилучший источник при биосинтезе пенициллина. Изменение кол-ва серы в среде приводит к изменению физиологических процессов в мицелии продуцента, а также уровня образования пенициллина в культуральной жидкости. Сера является антагонистом фосфора при их совместном воздействии на мицелий гриба. При повышенных концентрациях фосфора в среде наблюдается развитие гиф мицелия, не продуцирующих пенициллин, а при добавлении к среде серы в избытке наибольшее кол-во биомассы составляет продуктивный мицелий.
Витамины. Обмен веществ в клетке м/о без них не может протекать.
По потребности в витаминах все м/о делятся на два типа: автотрофы – способные синтезировать витамины и не требующие их введения в среду, и ауксогетеротрофы – неспособные синтезировать витамины и требующие их введения в среду. Многие м/о-продуценты в микробиологической пром-ти относятся к ауксогетеротрофам. Чаще всего для них необходим комплекс витаминов группы В (тиамин, никотиновая кислота, пантотеновая кислота, пиридоксин, инозит и биотин). Наибольший недостаток у м/о обнаруживается в биотине. Потребность в витаминах устанавливается экспериментально для каждого штамма. Т.к. витамины входят в состав ферментов, поэтому их нужно небольшое кол-во (тысячные доли мг в 1 л среды). Витамины вносятся либо с сырьем, в котором они содержатся, либо отдельно.
Вода. Для приготовления питательных сред воду берут из водопровода, артезианских скважин или открытых водоемов после соответствующей обработки. Вода должна быть биологически чистой, бесцветной, без привкуса и запаха, не должна давать осадка. Сухой остаток воды не должен превышать 1000 мг/л, общая жесткость не должна быть больше 7 мг-экв/л. Слишком жесткая вода замедляет рост м/о. Содержание вредных примесей не должно превышать следующих значений (мг/л): Pb – 0,1; Zn – 5,0; As – 0,05; Cu – 3,0; F – 1,5. Общее число м/о в 1 л воды не должно превышать 100. Для исследовательских целей воду берут дистиллированную, а все необходимые компоненты вносят в химически чистом виде.
Синтетические потребности микроорганизмов и способы получения ими энергии весьма разнообразны, следовательно, различны и их потребности в источниках питания. По этой причине не существует универсальной среды одинаково пригодной для культивирования любого микроорганизма. Подбор среды для культивирования м.о. зависит от цели исследования или выращивания, биологических особенностей м.о. Условия культивирования и состав сред для целей накопления биомассы, спорообразования или накопления продуктов метаболизма не одинаковы.
При приготовлении сред важно учитывать требования микроорганизмов к кислотности среды. Для каждого микроорганизма имеется своя оптимальная зона рН, в пределах которой он может нормально развиваться. Концентрация водородных ионов в питательной среде влияет на усвоение микроорганизмами источников питания, на направление и скорость биохимических реакций. Поэтому после приготовления среды проверяют значение рН и если необходимо, доводят его до нужной величины растворами кислот или щелочей.
Получение БАВ микробным синтезом основано на использовании чистой культуры-продуцентов, то есть в среде не должны содержаться посторонние микроорганизмы. Поэтому после приготовления питательные среды должны бьггь простерилизованы.
В лабораторных условиях стерилизация осуществляется, главным образом, автоклавированием. Этот способ основан на прогревании сред насыщенным водяным паром при давлении выше атмосферного. Температура и длительность автоклавирования определяются составом питательной среды и находятся в интервале 110 - 120 ºС 15 - 30 мин. Питательные среды для выращивания микроорганизмов разливают в пробирки или колбы, которые перед стерилизацией закрывают ватно-марлевыми пробками, предохраняющими среду или культуру от попадания в них посторонних микроорганизмов из воздуха.
Важно также учитывать потребности микроорганизмов в свободном кислороде для осуществления окислительных процессов в клетке. Продуценты БАВ в основном относятся к аэробным микроорганизмам и в лабораторных условиях выращиваются в колбах, содержащих жидкую питательную среду, на качалках, встряхивающих колбы.
4. ПОРЯДОК ВЫПОЛНЕНИЯ РАБОТЫ:
Лабораторная работа выполняется на двух занятиях.
Занятие № 1:
1. Расчёт необходимого количества компонентов для приготовления ферментационной среды (согласно варианту).
2. Приготовление ферментационной среды.
3. Стерилизация приготовленной питательной среды.
4. Посев микроорганизма-продуцента в приготовленную жидкую питательную среду.
Занятие № 2:
1. Описание характера развития продуцента.
2. Оформление и обсуждение результатов.
4.1.Занятие № 1: Изучение технологии приготовления и стерилизации жидких питательных сред, а также ведения посева
Оборудование: электрическая плитка с водяной баней, весы аналитические, химические стаканы, стеклянные палочки, конические колбы, стеклянные цилиндры, стеклянные пипетки, спиртовки.
Ход работы:
4.1.1. Каждая подгруппа рассчитывает один из вариантов ферментационной среды для гриба Aspergillus niger в соответствии с заданием.
Если это 1-й вариант (контрольная среда), то в состав среды входят все элементы питания, необходимые для грибов (кроме микроэлементов). Если это 2 — 8-й варианты, то в каждом из них исключен какой-либо один элемент питания. Если это 9 — 11-й варианты, то в каждом из них присутствует какой-либо один микроэлемент.
Цель опыта - выяснить, как гриб будет развиваться в отсутствие или при дополнительном внесении какого-либо элемента питания.
Варианты состава ферментационных сред для продуцента (в %):
1. Полная питательная среда без микроэлементов, %: сахароза - 10,0; NH4NO3 — 0,3; КH2PO4 - 0,2; MgSO4 - 0,05; FeSO4 - 0,01.
2. Та же среда без углерода: исключена сахароза. Для компенсации осмотической активности среды можно внести соответствующее по осмотическому эквиваленту количество хлорида натрия (NaCI), который не оказывает влияния на развитие гриба.
3. Та же среда без азота: исключен NH4NO3.
4. Та же среда без фосфора: КH2PO4 заменен другой солью, содержащей эквивалентное количество калия, например KCI. При замене одной соли на другую катион замещается калием, анион - хлором; Сl не оказывает влияния на развитие гриба.
5. Та же среда без калия: КH2PO4 заменен эквивалентным количеством NaH2РO4.
6. Та же среда без серы: MgSO4 и FeSO4 заменены эквивалентными количествами MgCI2 и FeCI2, закисную соль железа можно заменить окисной.
7. Та же среда без магния: MgSO4 заменен эквивалентным количеством Na2S04.
8. Та же среда без железа: FeSO4 заменен эквивалентным количеством Na2S04.
9. Та же среда с добавлением микроэлементов: в состав среды вводят ZnSO4.
10. Та же среда с добавлением микроэлементов: в состав среды вводят MnSO4.
11. Та же среда с добавлением микроэлементов: в состав среды вводят Н3ВО3.
Концентрация соли, содержащей микроэлементы, во всех трех случаях (9 – 11 варианты) - 0,01%.
Получив задание, следует рассчитать эквивалентный процент замещающего вещества (это относится ко всем вариантам, за исключением первых трех). Если в каждом из этих вариантов исключить какую-либо соль, то одновременно удаляются два элемента питания вместо одного. Так, в 4-м варианте (среда без фосфора) при удалении КH2PO4 одновременно исключаются фосфор и калий. Поэтому калий необходимо внести в среду в эквивалентном количестве в виде КСl.
Aspergillus niger — аэробный организм, поэтому для создания лучших условий аэрации спользуют колбы Эрленмейера объемом 75 — 100 мл с 30 мл среды.
Далее рассчитывают количество каждого вещества в граммах в 30 мл среды, зная их процентное содержание. Так как навески в большинстве своем очень малы, что затрудняет взвешивание, удобнее использовать готовые растворы: 20%-ный раствор сахарозы, 1%-ный раствор микроэлементов, 10%-ный — для всех остальных солей. Для этого надо определить, сколько миллилитров каждого раствора следует взять, чтобы внести соответствующую навеску.
Рассчитав все ингредиенты (в мл) для каждого варианта, вносят их в колбу.
Просуммировав объемы растворов в каждом варианте и, вычтя полученные суммы из 30, получают количество дистиллированной воды, которое надо добавить в каждую колбу.
Результаты расчётов свести в таблицу.
Таблица
| Компонент | Содержание в среде, % | Содержание в среде, гр. |
Каждая подгруппа готовит один из вариантов ферментационной среды согласно расчёту.
Среду готовят в стакане. Все необходимые соли и сахарозу вносят тщательно отмытыми пипетками. Сначала пипетки моют под струей водопроводной воды, затем ополаскивают дистиллированной водой. Объемы, составляющие целое число миллилитров, вносят градуированной пипеткой на 10 мл с делениями 0,1 мл, а десятые и сотые их доли – микропипеткой на 1 мл с делениями 0,01 мл.
Стерилизация среды
Стерилизацию ведут при кипячении среды в течение 10-15 минут. Так как в этом случае вода частично испаряется, после окончания процесса стерилизации нужно оценить потери воды и довести объём питательной среды стерильной дистиллированной водой до метки, соблюдая правила асептики.
Среды перед внесением спор гриба можно не стерилизовать, так как высокая концентрация сахара и кислая реакция среды за счет кислых солей калия, магния и железа препятствуют росту бактерий.
4.1.4 Посев гриба Aspergillus niger в приготовленную жидкую питательную среду
Посевом в микробиологии называется внесение микроорганизма в стерильные питательные среды, а также перенос уже выращенных микроорганизмов из одного сосуда (пробирки) в другой (колбу), содержащий стерильную питательную среду, При посеве микроорганизмов необходимо строго соблюдать условия, которые позволили бы предохранить культуру продуцента от загрязнения другими микроорганизмами.
Работу с культурами микроорганизмов лучше всего осуществлять в специальном помещении — боксе. Бокс представляет собой небольшую изолированную комнату. Оборудование бокса состоит из стола с легко моющейся поверхностью, стула, спиртовки и бактерицидной лампы. Все оборудование бокса периодически моют и обрабатывают дезинфицирующими растворами, а перед работой бокс облучают ультрафиолетовыми лучами в течение 60 минут.
Возможен посев микроорганизмов и непосредственно на рабочем месте. В этом случае рабочее место требует тщательной обработки (дезинфекции). Для протирания поверхности стола используют 70 % раствор изопропилового или этилового спирта.
Если посев ведут непосредственно из пробирки в колбу, то порядок работы следующий:
а) Протереть поверхность стола дезинфицирующим раствором.
б) Зажечь спиртовку.
в) Пробирку с продуцентом взять в левую руку таким образом, чтобы хорошо была видна вся поверхность питательной среды с выросшей на ней культурой. Пробирка должна находиться в горизонтальном положении или несколько наклонно.
г) Взять в правую руку бактериологический крючок или лопатку и простерилизовать в пламени горелки.
д) Не выпуская из руки петли, мизинцем и безымянным пальцем правой руки прижать ватную пробку к ладони, вынуть ее из пробирки и держать ее так во время последующих манипуляций.
е) Ввести бактериологическую лопатку в пробирку и захватить культуру микроорганизма вместе с агаризованной средой (площадью 1 см ). Закрыть пробирку и положить ее на стол.
ж) Удерживая лопатку указательным и большим пальцами правой руки, захватить мизинцем и безымянным пальцем ватную пробку колбы, прижать ее к ладони и открыть колбу около пламени горелки. Опустить лопатку с культурой в жидкую питательную среду. Закрыть колбу.
з) Лопатку обжечь в пламени горелки.
Возможен вариант засевания колбы жидким посевным материалом, который готовится предварительно: берут пробирку с посевным материалом, добавляют расчётное количество стерильной дистиллированной воды, тщательно взбалтывают для получения суспензии спорового материала (если необходимо, то можно воспользоваться бактериологическим шпателем для лучшего снятия спор с поверхности агара).
Если посевную культуру берут из жидкой среды, то порядок работы следующий:
а) Протереть поверхность стола дезинфицирующим раствором.
б) Зажечь спиртовку.
в) Колбу с продуцентом взять в левую руку таким образом, чтобы не смочить её края и пробку. г) Взять в правую руку стерильный цилиндр и его края обжечь в пламени горелки.
д) Не выпуская из руки цилиндр, мизинцем и безымянным пальцем правой руки прижать ватную пробку к ладони, вынуть ее из пробирки и держать ее так во время последующих манипуляций.
е) Перелить нужное количество суспензии из колбы в цилиндр. Обжечь края колбы и пробку в пламени горелки. Закрыть колбу и поставить её на стол.
ж) Удерживая цилиндр указательным и большим пальцами правой руки, захватить мизинцем и безымянным пальцем ватную пробку колбы со средой, прижать ее к ладони и открыть колбу около пламени горелки. Обжечь края цилиндра в пламени горелки и перелить споровую суспензию в колбу. Цилиндр можно положить на стол. Обжечь края колбы и пробку в пламени горелки. Закрыть колбу.
Качалочную колбу с посеянной культурой актиномицета подписать карандашом по стеклу или прикрепить этикетку с указанием варианта и установить в термостат (при 26 - 28 ºС) или на качалку (n = 200 — 220 мин -1) в термостатируемом помещении (при 26 - 28 ºС).
Продолжительность ферментации — 7 суток.
4.2.Занятие № 2: Описание характера развития микроорганизма-продуцента в глубинной культуре.
ОСНОВНЫЕ СВЕДЕНИЯ:
Микроорганизмы являются неиссякаемым источником различных полезных для человека веществ. Среди них особое место занимают микроорганизмы, образующие антибиотики, ферменты, аминокислоты, витамины и др. соединения.
Антибиотики — это низкомолекулярные вещества, вырабатываемые микроорганизмами в процессе их жизнедеятельности, способные задерживать или полностью подавлять рост других микроорганизмов. Это свойство позволило применять их для борьбы с болезнетворными микробами и лечения инфекционных заболеваний.
Ферменты — это биологические катализаторы белковой природы, образуемые живой клеткой и обладающие способностью активировать различные биохимические реакции. Ферменты используют в медицине, в основном, для лечения наследственных нарушений синтеза определенных ферментов организмом или снижения их активности у пожилых людей.
Технология микробиологического синтеза — это наука о процессах и методах переработки микроорганизмами или продуктами их жизнедеятельности исходного сырья в ценные для человека продукты — антибиотики, аминокислоты, витамины, ферменты, кормовой белок и др. Для выращивания микроорганизмов продуцентов антибиотиков и ферментов (ферментации) применяют два способа культивирования — поверхностный и глубинный.
Технология выращивания микроорганизмов поверхностным способом довольно проста. Она заключается в том, что микроорганизмы культивируют на поверхности твердых или жидких питательных сред. В качестве твердых питательных сред используют агаризованные среды или сыпучие субстраты (пшено, ячмень, пшеничные отруби и т. п.). Агаризованные питательные среды стерильно разливают по пробиркам или чашкам Петри и засевают на них микроорганизм-продуцент. После засева культуры на стерильную питательную среду пробирки или чашки Петри помещают в термостат, где при определенной температуре происходит рост и развитие микроорганизмов.
Сыпучие субстраты равномерно распределяют слоем в специальные кюветы (противни) или колбы, которые после засева посевного материала также помещают в термостат. Выращивание микроорганизма при оптимальных условиях продолжается в течение нескольких дней. Процесс выращивания микроорганизмов поверхностным способом заканчивается за определенный период времени и поэтому является периодическим.
Выращивание микроорганизмов глубинным способом происходит во всем объеме жидкой питательной среды в аппарате-ферментаторе, а в лабораторных условиях в колбах на специальных качалках. Выращивание микроорганизмов глубинным способом может быть периодическим и непрерывным.
При периодическом способе глубинного культивирования в ферментатор загружают сразу весь объем питательной среды и вносят посевной материал. Выращивание микроорганизмов проводят в оптимальных условиях в течение определенного времени, после чего процесс останавливают, сливают содержимое ферментатора и выделяют целевой продукт.
При непрерывном способе глубинного культивирования питательная среда непрерывно подается в ферментатор, в котором создают оптимальные условия для роста микроорганизмов, а из ферментатора также непрерывно вытекает культуральная жидкость, содержащая остатки питательной среды и клетки микроорганизма.
Основные условия процесса ферментации:
Для успешного проведения процесса ферментации и достижения высокого уровня накопления антибиотика помимо использования оптимальной среды, необходимо соблюдать определенные условия ведения процесса:
- не допускать загрязнения культуры продуцента посторонними микроорганизмами, иными словами обеспечить стерильность процесса ферментации;
- поддерживать необходимую температуру;
- соблюдать оптимальное значение рН среды и культуральной жидкости в процессе ферментации;
- обеспечивать культуру достаточным количеством кислорода;
- не допускать интенсивного вспенивания.
Стерильность процесса: Отсутствие посторонней микрофлоры (стерильность процесса) при выращивании продуцентов антибиотиков или ферментов является одним из наиболее важных факторов. Для обеспечения стерильности процесса вся аппаратура и коммуникации герметизируются, стерилизуются и держатся под давлением. Питательная среда и поступающий на аэрацию воздух стерилизуются. Засев ферментатора, отбор проб из него производится в асептических условиях, т. е. в условиях, препятствующих попаданию посторонней микрофлоры. Развитие посторонней микрофлоры опасно во многих отношениях:
1. Прежде всего, посторонние микроорганизмы, развиваясь в питательной среде, видоизменяют ее и тем самым нарушают оптимальные условия биосинтеза, что приводит к снижению уровня накопления антибиотика.
2. Наличие посторонней микрофлоры затрудняет дальнейшую обработку культуральной жидкости, отделение ее от мицелия и приводит к получению некачественного нативного раствора.
3. Продукты жизнедеятельности посторонних микроорганизмов могут загрязнять получаемый антибиотик и снижать его качество.
Температура: Для биосинтеза каждого антибиотика требуется определенная температура. Так, для биосинтеза пенициллина грибом Ре n. с rysogenum оптимальной является температура 25 - 26 ºС, в то время как при образовании антибиотиков актиномицетами обычно поддерживают более высокую температуру – 27 - 29 ºС. Однако этот уровень температуры не является наилучшим для биосинтеза всех антибиотиков, которые образуются актиномицетами. При биосинтезе эритромицина культурой S. erythreus наиболее благоприятной является температура 31 - 32 ºС. В процессе ферментации вследствие интенсивно протекающих процессов выделяется значительное количество тепла. Поэтому для поддержания температуры на желательном уровне необходимо постоянное охлаждение среды.
рН: Для биосинтеза большинства известных антибиотиков оптимальный рН близок к нейтральному. При значительном закислении или защелачивании среды процесс биосинтеза тормозится. Кроме того, многие антибиотики в щелочных или кислых условиях неустойчивы и быстро инактивируются. Изменение рН среды в процессе ферментации зависит в основном от состава питательной среды и характера процесса метаболизма. Для регулирования рН в питательные среды для получения антибиотиков часто добавляют некоторое количество мела. Мел реагирует с возникающими в процессе метаболизма кислотами, образуя нейтральные соли и углекислый газ, который удаляется из среды. Поэтому наличие в среде мела предотвращает возможность нежелательного закисления среды.
Аэрация и перемешивание: Все продуценты антибиотиков являются аэробными микроорганизмами и требуют для роста и развития наличия растворенного кислорода. Во время ферментации происходит одновременно два процесса – растворение кислорода в питательной среде и потребление кислорода микроорганизмом.
Микроорганизмы используют для дыхания только растворенный в среде кислород, поэтому обеспеченность микроорганизма кислородом определяется скоростью его растворения в культуральной жидкости. При глубинном культивировании микроорганизмов в промышленных масштабах этот процесс осуществляется путем пропускания воздуха через питательную среду и культуральную жидкость с помощью специальных аэрирующих приспособлений – барботеров. При этом жидкость одновременно интенсивно перемешивается.
Основное назначение аэрации и перемешивания — это снабжение культуры кислородом. Однако одновременно эти процессы способствуют поддержанию мицелия в равномерно взвешенном состоянии и выравниванию концентрации питательных веществ и продуктов обмена в культуральной жидкости.
При проведении глубинной ферментации в лабораторных условиях в качалочных колбах степень аэрации зависит от интенсивности перемешивания жидкости в колбе, т.е. от скорости
вращения и величины эксцентриситета качалки и объема среды в колбе.
Вспенивание: Питательные среды, применяемые при получении антибиотиков, содержат вещества, способные образовывать весьма стойкие пены. Аналогичные вещества могут возникатьв процессе ферментации.Аэрация и перемешивание среды вызывают образование слоя пены на поверхности жидкости, что ухудшает условия развития продуцента. Борьба с пенообразованием, т.е. пеногашение, осуществляется главным образом путем добавления поверхностно активных веществ, способствующих снижению стойкости пены и в дальнейшем ее разрушению. В качестве таких веществ в отечественной промышленности применяют различные жиры и растительные масла.
Ход работы:
Дата добавления: 2022-06-11; просмотров: 45; Мы поможем в написании вашей работы! |
Мы поможем в написании ваших работ!