Что такое культура, смешанная культура, чистая культура, штамм и колония бактерий?

Микробиология. МПД 20. Практическое занятие № 6.

Тема: «Изучение культуральных свойств микроорганизмов»

Цель занятия. Освоить технику посева микроорганизмов на плотные и жидкие питательные среды и методы выделения чистых бактериальных культур. Ознакомить студентов с основными культуральными характеристиками микроорганизмов и методами определения количества бактерий.

Оборудование и материалы. Бульонные и агаровые культуры В. cereus, Е. coli и S. aureus в пробирках и в чашках Петри, смешанная бульонная культура Е. соli и S. aureus, стерильные МПА и МПБ в пробирках, чашках Петри, солевой МПА (8 % хлорида натрия) в чашках Петри, стеклянные шпатели, стерильные пипетки Пастера, бактериологические петли.

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

Культура микроорганизмов — это популяция (расплодка) клеток на питательной среде. Посев и пересев культур микроорганизмов на питательные среды — наиболее частый методический прием, который используют для первичного выделения микроорганизма из какого-либо объекта, а также для поддержания культур в жизнеспособном состоянии в лабораторных условиях.

Чистая культура — это популяция бактерий одного вида или биологического варианта (биовара), выращенная на питательной среде.

Штаммы — чистые культуры микроорганизмов одного вида, выделенные из разных объектов или из одного и того же объекта, но в разное время.

Колония — макроскопически видимое скопление клеток микроорганизма на поверхности или внутри плотной питательной среды, образовавшихся в результате размножения одной жизнеспособной клетки. По этой причине колонию обычно рассматривают как чистую культуру микроорганизма.

Техника посева микроорганизмов. Посевы из нативного материала чаще проводят пастеровской пипеткой, из культур микроорганизмов—бактериологической петлей в зоне стерильного воздуха над пламенем горелки. На культуральных сосудах (пробирки, чашки Петри, колбы и т.д.) пишут номер экспертизы, под которым зарегистрирован материал, дату посева.

Посев на жидкую питательную среду. Пробирку с исследуемым материалом и пробирку с питательной средой держат в левой руке, в правую руку берут бактериологическую петлю или пипетку и'пробки от пробирок (рис. 37). Над пламенем горелки обжигают края пробирок, бактериологическую петлю (пипетку) вводят в пробирку с материалом, переносят материал в пробирку со стерильной питательной средой и стряхивают с петли в среду, не смачивая при этом петледержатель. Края пробирок вновь проводят над пламенем горелки, закрывают пробирки пробками, стерилизуют петлю и ставят ее в штатив. Использованную пипетку опускают концом вниз в банку с дезинфицирующим раствором.

Посев на плотную питательную среду. Выполняют разными способами.

При посеве в пробирку:

1) пробирки с засеваемой микробной культурой и питательной средой (МПА) берут в левую руку, пробирку с МПА держат скошенной поверхностью среды вверх. В открытую у пламени пробирку с микробной культурой (или другим материалом) вводят простерилизованную бактериологическую петлю, слегка прикасаясь петлей к поверхности среды (материала), берут материал, переносят его в пробирку со стерильной питательной средой. Петлю опускают до дна пробирки, погружают в конденсационную жидкость и зигзагообразным движением проводят снизу вверх по поверхности среды (посев «штрихом») Пробирки закрывают пробками, петлю прожигают. Пробирки с посевами ставят в термостат;

2) при посеве уколом в столбик среды пробирку с плотной (нескошенной) средой берут в левую руку, над пламенем горелки извлекают из пробирки пробку, петлей с материалом прокалывают вертикально по центру пробирки питательную среду, петлю вынимают, прожигают, пробирку с засеянной средой закрывают пробкой.

При посеве на чашку Петри: чашку берут в левую руку, большим пальцем левой руки слегка приподнимают крышку, обжигают на пламени горелки края чашки в зоне щели, вносят посевной материал на поверхность питательной среды, затем растирают его при помощи стеклянного шпателя или бактериологической петли

Посев на полужидкую питательную среду. Выполняют методом укола в столбик питательной среды.

Выделение чистых культур микроорганизмов. При бактериологическом исследовании искомый микроорганизм обнаруживают в материале, как правило, в смеси с бактериями других видов. Классическими методами бактериологии возможно идентифицировать микроорганизм только при условии, что он находится в виде чистой культуры.

Методы, основанные на механическом разобщении клеток. Эти методы наиболее часто применяют при выделении чистых культур микроорганизмов.

Метод Пастера (метод разведений): из исследуемого материала готовят ряд последовательных, чаще десятикратных разведений на стерильной жидкой питательной среде в пробирках или колбах (10-1…10-10). Предполагают, что количество микробных клеток в каждом последующем разведении будет меньше, чем в предыдущем, и в какой-то из пробирок останется только одна микробная клетка, которая и даст/начало чистой культуре Микроорганизма. Однако для успешного применения этого метода необходимо, чтобы искомый микроорганизм в материале количественно преобладал над сопутствующими видами.

Метод Коха (метод заливок): исследуемый материал в небольшом количестве вносят в пробирку с расплавленным и охлажденным до 45...50 "С МПА, перемешивают, затем каплю питательной среды переносят во вторую пробирку с расплавленным МПА и т. д. Количество разведений зависит от предполагаемой численности микроорганизмов в исследуемом материале. Затем содержимое каждой пробирки выливают в стерильные чашки Петри, после затвердения среды посевы помещают в термостат. Фиксированные в плотной среде микробные клетки при размножении формируют колонии, из которых можно отвить (пересеять) чистую культуру микроорганизма.

Метод Дригальского: берут три—пять чашек Петри с плотной питательной средой. В одну из чашек вносят посевной материал и распределяют его шпателем по поверхности питательной среды. Не обжигая шпатель, оставшийся на нем материал последовательно растирают на поверхности среды во второй, третьей и остальных чашках. В последних чашках Петри после инкубирования в термостате обычно наблюдают формирование изолированных колоний бактерий.

Более экономичен следующий способ получения изолированных колоний. Бактериологической петлей с посевным материалом несколько раз делают параллельные штрихи в одном секторе чашки Петри с питательным агаром. Пет- о лю прожигают в пламени горелки, дают остыть и часть материала из первого сектора {А) аналогичным образом распределяют во втором секторе (В), затем в третьем (С) и четвертом (Д) секторах. Даже при рассеве бактериальной массы из колоний в секторе Д при таком способе получают рост изолированных колоний.

Методы, основанные на биологических особенностях микроорганизмов. Направлены на подавление роста сопутствующей микрофлоры.

Прогревание: при выделении чистой культуры споро-образующего вида бактерий исследуемый материал прогревают при 80 °С 20 мин или кратковременно кипятят. Вегетативные клетки сопутствующей микрофлоры в этих условиях погибают, а споры искомого микроорганизма сохраняют жизнеспособность и прорастают после посева на питательные среды.

Использование селективных питательных сред, которые содержат вещества, подавляющие рост сопутствующей микрофлоры (антибиотики, красители и т. д.), — частый прием при исследовании контаминированного материала. Однако необходимо учитывать, что селективные факторы часто находятся не в бактерицидных, а в бактериостатических концентрациях, поэтому клетки сопутствующих микроорганизмов не растут, но остаются жизнеспособными на поверхности питательной среды и при отвивке колоний исследуемой культуры на обычные среды могут быть причиной получения смешанной культуры.

Биопроба — заражение чувствительных лабораторных животных — метод, с помощью которого не только выделяют возбудитель из патологического материала, но также изучают вирулентность чистой культуры. Организм животного с его защитными факторами служит биологическим «фильтром», который уничтожает сопутствующую непатогенную микрофлору, но не способен подавить размножение вирулентных бактерий, что позволяет достаточно легко выделить возбудитель в чистой культуре из тканей погибшего или убитого с диагностической целью животного.

При выделении чистых культур некоторых видов бактерий используют их другие биологические особенности. Например, способность микроорганизма расти при низких (листерии) или высоких (термофильные бактерии) температурах, которые лежат за пределами температурных диапазонов сопутствующих видов бактерий. Для выделения культуры P. vulgaris используют способность данного вида давать ползучий рост (роение) на поверхности плотной питательной среды. С этой целью материал, содержащий P. vulgaris, засевают в конденсационную воду на дне пробирки со скошенным МПА, не касаясь поверхности среды. Сопутствующая микрофлора растет в нижней части питательной среды, а протей в виде прозрачной пленки распространяется вверХ.

Для выделения С. tetani материал засевают точечно на плотную питательную среду в чашках Петри и после выращивания отвивают культуру с периферии ползучего роста.

Культуральные свойства микробов

Культуральные признаки микробов определяются характером роста их на питательных средах. Будучи постоянными, для каждого вида микроба, они являются важным диагностическим признаком.

Рост микробов на плотной питательной среде.

Для изучения свойств колоний микробы культивируют на плотных питательных средах в чашках Петри. При посеве материала стараются получить изолированный рост колоний. Чашки с посевом просматривают сначала невооруженным глазом или через лупу, затем помещают их на столик микроскопа вверх дном и просматривают колонии в проходящем свете с объективом малого увеличения и с суженной диафрагмой. Колонии характеризуют по величине, форме, контуру края, рельефу, поверхности, цвету, структуре и консистенции.

Величина колонии определяется ее диаметром. В зависимости от диаметра различают колонии точечные (диаметр меньше 1 мм), мелкие (диаметр 1—2 мм), средние (диаметр 2—4 мм) и крупные (диаметр 4—6 мм и более).

Форма колонии бывает правильная — круглая, неправильная — амебовидная, ризоидная — корневидная, напоминающая переплетающиеся корни деревьев.

Характер контура края определяют при рассмотрении колонии под лупой или микроскопом с малым увеличением. Различают ровные края в виде четко выраженной линии и неровные. Последние делят на:

фестончатый край, состоящий из крупных, слегка округлых или уплощенных зубцов правильной формы;

волнистый край, который несколько отличается от фестончатого тем, что крупные зубцы его выражены нечетко;

эрозированный, или зазубренный, край, состоящий из острых зубцов различной величины и формы;

бахромчатый край, имеющий нежные ворсинки.

В некоторых случаях четко выраженная линия, отграничивающая колонию от поверхности среды, отсутствует. Такой край колонии называется расплывчатым.

Рельеф (профиль) колонии характеризуется приподнятостью ее над поверхностью питательной среды и контуром формы в вертикальном разрезе. Определяется рельеф колонии невооруженным глазом или с лупой при рассматривании сверху и сбоку.

Различают: 1) каплеобразные и куполообразные колонии правильной круглой формы с различно выраженной степенью выпуклости, которые в вертикальном разрезе представляют собой сегмент шара и отличаются только длиной радиуса. Колонии слабовыпуклые имеют большую длину радиуса; куполообразные — меньшую;

2) колонии плосковыпуклые с плоским верхом, пологими или круто обрывающимися краями; имеют в вертикальном разрезе форму трапеции;

3) колонии конусообразные, имеющие в вертикальном разрезе форму треугольника:

4) колонии с приподнятой в виде соска серединой и валиком по периферии;

5) колонии с вдавленным центром;

6) колонии плоские, стелющиеся по поверхности среды.

Культуральные свойства микроорганизмов. В процессе идентификации наряду с другими свойствами у микроорганизмов изучают культуральные признаки — особенности роста на плотных, жидких и полужидких питательных средах при определенных условиях.

На плотных средах изучают колонии микроорганизмов. Бактерии каждого вида формируют колонии с определенными признаками, которые обычно учитывают при идентификации. Размер колоний: крупные — диаметром 4...6 мм и более, средние—2...4 мм, мелкие — 1...2мм и точечные колонии диаметром менее 1 мм. Форма колоний может быть правильной круглой, неправильной (амебовидной, розеткообразной), корневидной. Цвет зависит от способности микроорганизма образовывать пигмент: белый, желтый, красный, сине-зеленый и т. д. Бактерии, не синтезирующие пигмент, формируют бесцветные колонии. Учитывают характер поверхности, которая может быть шероховатой, блестящей, матовой, сухой, влажной, гладкой, радиально или концентрически исчерченной. Края колонии могут быть ровными, волнистыми, зазубренными, бахромчатыми, их исследуют невооруженным глазом и под малым увеличением микроскопа. Рельеф (профиль) определяют, рассматривая колонию сбоку; различают плоские, конусообразные, куполообразные, плоские с конусовидным центром или углублением в центре колонии, с утолщенными (валикообразными) краями. Учитывают прозрачность колонии: непрозрачная, полупрозрачная, прозрачная. Структура может быть однородной, зернистой, волокнистой и т.д.. Ее выявляют при слабом увеличении микроскопа. Консистенция может быть пастообразной, слизистой, плотной (сухой) и т.д.; ее определяют, дотрагиваясь до колонии бактериологической петлей. Колонии некоторых видов врастают в толщу питательной среды, что также определяют при помощи бактериологической петли. Запах: многие виды бактерий в процессе роста на питательных средах выделяют специфические ароматические вещества.

Ценную дополнительную информацию об особенностях строения колоний дает их изучение в косопадающем пучке света. Культуры на прозрачной агаровой среде в чашках Петри помещают на предметный столик бинокулярной лупы. Между бинокулярной лупой и источником света помещают зеркало от микроскопа вогнутой стороной вверх таким образом, чтобы лучи, отраженные от него, попадали в плоскость изучаемого объекта под углом 40...45°. Зеркало устанавливают на равном удалении от объекта и источника света (12...14 см). При таком освещении колонии бактерий могут быть окрашены в различные цвета. Цвет зависит как от видовых особенностей, так и от состояния культуры (S-, R-формы).

В жидких средах учитывают следующие признаки: степень помутнения среды (интенсивное, среднее, слабое), наличие или отсутствие пристеночного кольца на границе мениска и внутренней поверхности пробирки, характер поверхностной пленки (толщина, цвет, поверхность), характер осадка (обильный, скудный, компактный, хлопьевидный, слизистый). При характеристике осадка пробирку слегка встряхивают и учитывают результат: осадок разбивается в гомогенную равномерную суспензию; образуются мелкие или крупные хлопья, глыбки; слизистый осадок при встряхивании обычно поднимается в виде косички. Пигментообразующие микроорганизмы вызывают окрашивание питательной среды и осадка (желтое, зеленоватое, красное и т. д.).

Определение количества бактерий. При характеристике развития микробной популяции, санитарной оценке кормов, продуктов питания, при вычислении показателя вирулентности микроорганизма необходимо устанавливать количество микробных клеток в единице объема того или иного материала.

Определение общего количества микроорганизмов. Можно применять метод прямого счета и метод измерения светорассеяния.

Метод прямого счета: бактерии подсчитывают в камерах Горяева, Тома или в окрашенных мазках. В последнем случае 0,01 мл бактериальной суспензии микропипеткой наносят на предметное стекло и равномерно распределяют на 1 см2. Мазок фиксируют, окрашивают и подсчитывают клетки в 10... 15 полях зрения по диагонали квадрата. Определяют среднее число клеток в одном поле зрения. Делят 1 см2 на площадь поля зрения, которую измеряют методом микрометрии, затем частное умножают на среднее число микробных клеток в поле зрения, получают их количество в 0,01 мл взвеси бактерий.

Метод измерения светорассеяния считают более точным. Количество света, рассеиваемого суспензией бактерий, пропорционально их концентрации.

Учет результатов: в чашках Петри, где выросло более 150...300 и менее 10 колоний, результаты не учитывают. Выбирают чашки Петри с параллельными посевами (из одного разведения), содержащими 10... 150 колоний. Подсчитывают колонии на чашках из одного разведения, суммируют, определяют среднее число колоний и с учетом степени разведения рассчитывают содержание жизнеспособных клеток (колониеобразующих единиц) в 1 мл исходной суспензии бактерий.