Получение и количественное определение гликогена печени, мышц, мозга по Гуду, Кремеру, Шомодьи.
Материал исследования: печень, скелетные мышцы, сердце, мозг, почки.
Принцип метода. Ткань подвергается десмолизу в 30%-ном гидроксиде калия (заменять на гидроксид натрия нельзя, так как при этом образуются плохо растворимые в спирте натриевые мыла и сода - это затрудняет последующую очистку осадка гликогена). Из десмолизата гликоген осаждается спиртом.
Реактивы: 1) 30%-ный и 60%-ный раствор гидроксида калия; 2) 70%-ный, 80%-ный и 96%-ный этиловый спирт; 3) 2N соляная или серная кислота; 4) 5N и 0,5N гидроксид натрия; 5) индикатор (фенол красный, лакмусовая бумага); 6) жидкий кислород или азот.
Оборудование: центрифуга, центрифужные пробирки, холодильник, термостат, технические весы с разновесами, штативы с пробирками, пипетки, бюретки, ступки.
Порядок выполнения работы
Навеску ткани (0,5-2,0 г) переносят в гомогенизатор. Затем в колбу, содержащую 10 мл горячего 30 %-ного гидроксида калия; колбу помещают в кипящию водяную баню на 20 мин и по охлаждении приливают 12,5 мл 96 %-ного спирта; смесь взбалтывают, погружают в горячую воду и осторожно доводят до кипения, затем охлаждают, центрифугируют в течение 15 мин при 3000 об/мин; жидкость декантируют, пробирку с осадком гликогена опрокидывают на фильтровальную бумагу на 1-2 мин. В случае необходимости можно произвести переосаждение; осадок растворить в 10 мл воды, прибавить к нему 12,5 мл 96%-ного спирта и повторить описанную процедуру получения осадка гликогена.
|
|
|
Затем осадок промывают 1 раз 96 %-ным спиртом (5 мл) с последующим центрифугированием и декантацией промывных жидкостей. Остатки спирта удаляют нагреванием в водяной бане при 70-80°С и высушенный осадок гликогена подвергают дальнейшей обработке (гидролиз, количественное определение).
Гидролиз гликогена можно проводить в 1 N соляной или серной кислоте (в случае последующего определения глюкозы колориметрическим методом, так как ионы хлора мешают колориметрированию). Для этого осадок гликогена растворяют в 2-3 мл горячей воды, к раствору добавляют 2-3 мл 2 N соляной или серной кислоты, тщательно взбалтывают смесь, накрывают пробирку и ставят в термостат (90- 100°С) на 2,5 ч. Гидролизат после охлаждения нейтрализуют вначале 5N, а затем 0,5N раствором гидроксида натрия по индикаторам фенол красный или лакмусовая бумага. В нейтрализованном гидролизате определяют количество глюкозы по соответствующей методике, например, феррицианидным методом (см. разд. 1.2).
Ход определения
Осаждение рецидивирующих веществ. Нейтрализованный гидролизат гликогена количественно перенести в мерную колбочку объемом 25 мл, в нее добавить 2 мл кадмиевого реактива, через 7-10 мин – 0,25 мл 1,1 N раствора гидроксида натрия и воду до метки. Образующийся при этом осадок гидроксида кадмия является осадителем не только белков, но и веществ, обусловливающих остаточную редукцию. Спустя 20 мин смесь центрифугируют при 3000 об/мин в течение 10 мин и, если осадок плохо уплотняется, фильтруют через прокипяченную вату.
|
|
|
Опре деление глюкозы. На определение глюкозы берут 1-2 мл фильтрата в случае анализа гликогена печени, 5-10 мл при определении гликогена в мышечной ткани, 10 мл при определении гликогена в сердечной мышце. Названные объемы центрифугата (фильтрата) помещают в плоскодонную колбочку на 50 мл, приливают 2 мл 0,005N раствора феррицианида калия и воды до 15 мл. Далее анализ проводят, как описано в методике определения глюкозы феррицианидным методом. Количество гликогена вычисляют по формуле
где X – количество гликогена, мг %;
Vобщ – конечный объем гидролизата, обработанного гидроксидом кадмия, мл;
a – количество глюкозы в V мл фильтрата, мг;
Vоп – количество фильтрата, взятое для определения глюкозы, мл;
p – навеска ткани, г;
0,927 - переводной коэффициент глюкозы в гликоген. Он означает, что 1 г глюкозы, образовавшейся при гидролизе, соответствует 0,927 г гликогена. Этот коэффициент получен Неркингом в 1901 г.
|
|
|
Содержание гликогена в тканях животного организма в норме
(литературные данные)
| Орган | Содержание гликогена, мг% |
| Печень | 1243 |
| Мышцы | 250 |
| Мозг (большие полушария) | 72 |
Полученные результаты оформить в виде таблицы:
Экспериментальные данные о содержании гликогена в органах
| Орган | Содержание гликогена, мг% |
| Печень | |
| Скелетные мышцы | |
| Мозг | |
| Сердце | |
| Почки |
Сопоставляют полученные результаты с имеющимися литературными данными, обсуждают специфику каждого органа в отношении содержания гликогена и его использования, делают выводы.
Работа по определению глюкозы в печени: вследствие выделения гликогена из печени получен конечный объем гидролизата равный 23,5 мл; для проведения процедуры титрования отобрали 2,0 мл фильтрата; в результате титрования опытной и холостой проб, согласно табличным данным, количество глюкозы в пробе составило 101 мг. Определите количество гликогена в ткани в мг %, если масса навески ткани составила 1 г.
Работа по определению глюкозы в мышечной ткани: вследствие выделения гликогена из печени получен конечный объем гидролизата равный 22,5 мл; для проведения процедуры титрования отобрали 5,0 мл фильтрата; в результате титрования опытной и холостой проб, согласно табличным данным, количество глюкозы в пробе составило 31 мг. Определите количество гликогена в ткани в мг %.
|
|
|
Работа по определению глюкозы в миокарде: вследствие выделения гликогена из печени получен конечный объем гидролизата равный 24,0 мл; для проведения процедуры титрования отобрали 10,0 мл фильтрата; в результате титрования опытной и холостой проб, согласно табличным данным, количество глюкозы в пробе составило 37 мг. Определите количество гликогена в ткани в мг %.
Заполните таблицу с указанием концентраций гликогена в разных тканях. Сделайте общий вывод по работе.
Примечание: при оформлении лабораторной работы теоретическую часть не записываем, ход работы приводим кратко, представляем выполненные расчеты, конечные результаты и вывод. В конце работы отвечаем на один из вопросов, предложенных Вам к лабораторной работе. Оформленную в письменном виде работу высылаем на указанные электронные ресурсы.
Дата добавления: 2023-01-08; просмотров: 59; Мы поможем в написании вашей работы! |
Мы поможем в написании ваших работ!