Глава 2. Общие сведения о базе практики

⇐ ПредыдущаяСтр 2 из 3Следующая ⇒

Производственная практика проходила на базе кафедры биологии ФГБОУ ВО «Череповецкого государственного университета», а так же в учереждениях Череповецкого музейного объединения: в музее «Дом И.А. Милютина», в «Мемориальном доме-музее Верещагиных», и в ФГБУН Институте биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук.

Кафедра биологии обладает современной лабораторной базой:

1. оборудованы 7 учебно-исследовательских лабораторий (зоологии, экологии, ботаники, растениеводства, анатомии и физиологии человека, биохимии, физиологии растений и микроорганизмов);

2. созданы коллекции культивируемых организмов, макро-и микропрепаратов;

3. занятия обеспечены оптической, приборной и компьютерной техникой;

собрана биологическая библиотека и видеотека.

Часть работ проводились в лаборатории растениеводства (901 аудиотория).

Лаборатория растениеводства расположена на 9 этаже, включает в себя 3 помещения: холл, в котором находится оранжерея, гербарную комнату (901 а) и хозяйственную комнату (901 б).

Материальную базу лаборатории составляют горшечные коллекции растений, наборы сельскохозяйственных инструментов, наборы почв, удобрений, семян, различные гербарии растений.

Остальная работа проходила в лаборатории биохимии (231 аудиотория). Мы ознакомились с такими приборами как: инверсионно-вольтамперометрический анализатор "ИВА-5", Спектрофотометр ПЭ-5400УФ, электронный микроскоп Olympus CX41RF, жидкостной хроматограф «Люмохром» , ранцевая полевая лабо-ратория, анализатор ртути «РА-915+» с приставкой «ПИРО». Здесь проводились такие работы, как получение хлорофилльной вытяжки при помощи спирта из различных растений, микроскопирование на электронном микроскопе пыльцы растений, а так же выполнение индивидуального задания по теме « Содержание пигментов в донных отложениях рек города Череповца».

В период с 23.05.2016-10.06.2016 я проходила практику на базе ФГБУНИнституте биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук в лаборатории биохимии белка. В его состав входят исследовательские лаборатории, уникальные станция искусственного климата с лабораторией клональногомикроразмножения растений «Биотрон», научно-производственный комплекс для доклинических исследований медицинских препаратов «Биоцентр» и экологически чистая установка для термического уничтожения отходов химических и биохимических исследований.Обширная приборная база позволила ознакомиться с большим количеством методов работы на них. Основным направлением работы было очистка и выделение белков, и для этого проводилась работа с автоматическими пипетками «Biohit» и «Eppendorf», электрофорезом «Bioradminiprotein 2», центрифугами настольной «EppendorfminiSpin» и препаративнойBeckman J2-21M, жидкостным хроматографом низкого давления «Pharmacia FPLC system» .

Глава 3. Освоение методики работы на современном оборудовании

Лаборатории биохимии

Практика в биохимической лаборатории проводилась в 231 аудитории под руководством Непорожней И.А. и включала в себя работу и освоение методики работы на следующих приборах:

-Инверсионно-вольтамперометрический анализатор "ИВА-5", он предназначен для определения содержания различных элементов (меди, свинца, кадмия, хрома, цинка, никеля, молибдена, олова, марганца, мышьяка и др.) в природных, питьевых и сточных водах, пищевых продуктах и продовольственном сырье;

- Спектрофотометр ПЭ-5400УФ предназначен для измерения коэффициента пропускания и оптической плотности жидкостей (в том числе биологических) с целью определения концентрации растворенных в них компонентов, а также для измерения коэффициента пропускания и оптической плотности твердых и жидких проб различного происхождения;

- электронный микроскоп Olympus CX41RF предназначен для лабораторных исследований используется для выполнения микроскопирования препаратов в ходе каждодневной работы в медико-биологических лабораториях;

-термостат ТС-1/80 СПУ разработан для получения и поддержания стабильной температуры внутри рабочей камеры, необходимой для проведения бактериологических и серологических исследований;

-жидкостной хроматограф «Люмохром» позволяет реализовать метод высокоэффективной жидкостной хроматографии, который заключается в разделении веществ вследствие различного распределения между подвижной и неподвижной фазами с последующей регистрацией фотометрическим и/или флуориметрическим детекторами;

-ранцевая полевая лаборатория ( для полевых исследований воды и почвы);

-анализатор ртути «РА-915+» с приставкой «ПИРО» предназначен для прямого (без предварительной химической пробоподготовки) определения ртути в жидких и твердых образцах самого разнообразного состава ;

-морозильные камеры и холодильники для хранения проб;

-весы технические для взвешивания проб;

-весы аналитические для взвешивания проб;

-компьютер с программным обеспечением для работы на приборах;

-шкафы с лабораторной посудой и реактивами используются для подготовки проб в исследовании на приборах;

В ходе данной практики нами было выполнено два практических задания. Первое заключало в себе получение хлорофильной вытяжки при помощи спирта из 3 растений, таких как береза (Betulasp), лопух (Árctiumsp), филодендрон (Philodendron sp).

Проводилось растирание навески листьев при помощи пестика в ступке с добавлением этилового спирта 96%, речного песка и мела. Полученную вытяжку пигментов отфильтровывали при помощи фильтровальной бумаги, а затем производили измерения на спектрофотометре ПЭ - 5400уф. Для работы на нем его необходимо включить и подождать 20 минут для прогрева прибора. Вытяжку из растений наливают в кюветы, выставляют в приборе в шахматном порядке, закрывают крышку, выставляют на экране нужную длину волны, нажимают кнопку «ввод» и произвести измерения на таких длинах волн как 665 нм и 649 нм. Полученные данные отмечали в таблицу:

Таблица 1

Название растения	Масса навески, г	Оптическая плотность
Название растения	Масса навески, г	D₆₆₅	D₆₄₉
Береза (Betulasp)	1,0912	2,679	2,795
Лопух (Árctiumsp)	1,5450	2,711	2,862
Филодендрон (Philodendronsp)	1,1033	2,825	2,795

При помощи формул у нас получились следующие значения:для 96 % спирта:

Са= 13,7 ∙ D₆₆₅ – 5,76 ∙ D₆₄₉,

Св= 25,3 ∙ D₆₄₉ – 7,6 ∙ D₆₆₅,где Са – концентрация хлорофилла а в мг/л; Св – концентрацияхлорофилла в в мг/л; Ск – концентрация каротиноидов в мг/л;D – найденное для исследуемого экстракта поглощение (при толщине слоя 1 см) при указанных длинах волн.

Таблица 2

Название растения	С a, мг/л	С b, мг/л
Береза (Betulasp)	20,603	50,353
Лопух (Árctiumsp)	20,655	51,805
Филодендрон (Philodendronsp)	22,603	49,243

Определение количества пигментов в расчете на 1 г или 1 дм² проводится по формулам: А = (С∙V) / (1000∙m);где А – количество пигментов, в мг/г сухой или сырой массы;С – концентрация пигментов, в мг/л; V – объем вытяжки пигментов, в мл; m – навеска,в г;

Таблица 3

Название растения	А a, мг/г	A b, мг/г
Береза (Betulasp)	0,283	0,692
Лопух (Árctiumsp)	0,294	0,737
Филодендрон (Philodendronsp)	0,389	0,848

Рис.2 Вытяжки пигментов из растений

Рис.3 Спектрофотометр-5400 уф

Второе практическое занятие, это - микроскопирование пыльцы растений на электронном микроскопе Olympus CX41RF, таких как одуванчик обыкновенный (Taráxacumofficinále) и черемухи обыкновенной (Prúnuspádus).

Методика работы:включить компьютер, затем открыть программу «VideoZavr» и сознать новую учетную запись с указанием даты и времени. Следующий шаг – поместить препарат на предметный столик микроскопа, нажать кнопку «цифровая камера» и настроить светофильтр, свет и резкость. Нажать «баланс белого» и затем – «захват». Для измерения количества пыльцевых зерен и их длину нажимаем вкладку с таким названием и нажимаем «счетчик», «запись результатов с измерением» и «калибровочный график». После проделанной работы мы получили фотографии, представленные ниже (Рис. 4,5.) Нам удалось обнаружитьабортивную форму пыльцы одуванчика (Рис. 4. (справа)).


Рис. 4. Пыльца одуванчика (TaraxacumofficinaleWigg)	Рис. 5. Пыльца черемухи (Prunuspadus)

Также мы были ознакомлены с методикой выполнения работы на анализаторе ртути «РА-915+» с приставкой «ПИРО»:

Нужно включить батарею, нажать на кнопку «enter», «ok» и подождать 20 минут для прогрева прибора перед работой. На компьютере необходимо включить программу «Рапид», нажать «контроль работоспобности», «пуск», после команды «успешно» нажимаем «выход». Начинается анализ проб с выбора градуировки (градуировка 06102015), нажимаем «применить» и «пуск». Затем необходимо взять колбу с Hg 100мкг/л, и при помощи пипетки на 50мкл и активированного угля провести исследование 1 пробы.

Также нас ознакомили с методикой работы на инверсионно-вольтамперометрический анализаторе "ИВА-5":

Выполнение измерения массовых концентраций ионов Cu, Pb, Cd.

1.Формирование рабочей поверхности селективного (рабочего) электрода:

- собрать прибор: электрод сравнения (хлорсеребряный), вспомогательный (стеклоуглеродный) и рабочий электрод, рабочая поверхность которого должна быть направлена в центр рабочей ячейки с мешалкой;

- заполнить рабочую ячейку (химический стаканчик) 10 мл 0.5-молярного раствора HCl;

- открыть программу ИВА-2003. В открывшемся окне: Файл→Новый→Выбрать программу «Формирование поверхности»→выбрать тип электрода 5→Нажать кнопку Пуск.

Через некоторое время рабочая поверхность будет сформирована. Для дальнейшей работы необходимо промыть электроды дистиллированной водой. Рабочую ячейку заполнить исследуемым раствором.

2.Анализ проб воды на содержание Cu, Cd, Pb.

1)На содержание Cu (измеряется в интегральном режиме + границы поиска)

а) для проб с малым содержанием Cu

Готовится холостой раствор. Рабочая ячейка заполняется фоновым электролитом (10 мл 0.1 М HCl). Опустить электроды. Выбрать программы: Воды→ Cu. В окне «Панель инструментов» выбрать: при измерении холостой пробы - фон не включать и нажать «Пуск». Зарегистрировать кривую. Ввести добавку стандартного раствора определяемого элемента (0.05 мл АР-3). Зарегистрировать кривую. Проверить правильность занесенных объемов и концентраций, границы измерения пиков, если необходимо, поправить. Рассчитать содержание элементов в холостой пробе.

Далее в пустую рабочую ячейку налить 10 мл пробы, подкислить до 0.1 М раствора (0.2 мл 6 М HCl). Фон включать не нужно. Нажать «Пуск». Зарегистрировать кривые. Ввести добавку стандартного раствора 0.02 мл, концентрация которого 100 мкг/л (АР-3). Зарегистрировать кривую, проверить правильность занесенных объемов и концентраций. Добавить результат анализа холостой пробы, границы измерения пиков, если необходимо, поправить. Рассчитать содержание элемента.

При постоянной работе с одними и теми же реактивами холостую пробу достаточно сделать 1 раз. При смене реактивов необходимо сделать новую холостую пробу. Анализ холостой пробы первоначально делают 2-3 раза для получения воспроизводимых результатов.

Анализ пробы также необходимо повторить 3 раза. Если при анализе пробы не наблюдаются пики, то необходимо изменить диапазон тока (I=100) и времени (t=60). Повторить анализ.

б) Для проб с большим содержанием Cu (с разбавлением).

Основной объем рабочей ячейки заполняется рабочим электролитом (8-10 мл) 0,1 М HCl. Главное правильно указать в таблице этот объем. Выбор программы: Воды→ Cu. На панели инструментов – «Измерения», выбрать фон, нажать «Пуск». Регистрировать кривую. Далее ввести аликвоту анализируемой пробы (2-0.1 мл). Регистрировать кривую. Ввести добавку стандартного раствора 0,1 мл АР-3 (100 мкг/л). Зарегистрировать полученный результат. Проверить правильность заполнения таблицы, границу измерения пиков, при необходимости корректировать. Для получения более точного результата анализ повторяют 2-3 раза.

2)На содержание Cd (измеряется в диференциальном режиме + границы поиска)

а) для проб с малым содержанием Cd

Приготовление растворов, необходимых для проведения анализа

1.6-молярный раствор HCl

В мерную колбу на 100 мл, содержащую небольшое количество дистиллированной воды (очень чистой), приливают 50 мл концентрированной HCl. Объем раствора доводят до метки на колбе (до 100 мл).

2.0,5-молярный раствор HCl

В колбу на 500 мл, содержащую небольшое количество дистиллированной воды приливают 22.5 мл концентрированной HCl. Объем раствора доводят до метки на колбе (до 500 мл).

3.Приготовление основных растворов Cu, Pb, Cd из государственных стандартных образцов состава Cu, Pb и Cd с аттестованной концентрацией элемента 1 г/л (ОР)

В мерные колбы на 50 мл вводят 5 мл стандартного образца состава Cu, Pb, Cd (каждый элемент в отдельную колбу) и доводят объем раствора до 50 мл 0.1-молярным раствором HCl. Полученный раствор имеет концентрацию 0,1 г/л – основной раствор (ОР). ОР хранится 6 месяцев.

4.0,1-молярный раствор HCl

В мерную колбу на 500 мл, содержащую небольшое количество дистиллированной воды приливают 4.5 мл концентрированной HCl. Объем раствора доводят до 500 мл дистиллированной водой. (0.16 мл 6 М НСl, объем довести до 10 мл)

5.Приготовление аттестованных растворов (АР) Cu, Pb, Cd

АР-1 (хранится 1 месяц)

В колбу на 50 мл вносят 5 мл основного раствора нужного элемента (Cu, Pb или Cd). Объем раствора доводят до 50 мл 0.1-молярным раствором HCl. Концентрация полученного раствора составляет 10000 мкг/л (0.01 г/л или 10-3 г/л).

АР-2 (хранится 1 неделю)

В колбу на 50 мл вносят 5 мл АР-1 нужного элемента. Объем раствора доводят до 50 мл 0.1-молярным раствором HCl. Концентрация полученного раствора составляет 1000 мкг/л (0.001 г/л или 10-4 г/л).

АР-3 (готовится ежедневно)

В колбу на 50 мл вносят 5 мл АР-2 нужного элемента. Объем раствора доводят до 50 мл 0.1-молярным раствором HCl. Концентрация полученного раствора составляет 100 мкг/л (0.0001 г/л или 10-5г/л).

АР-4 (готовится ежедневно)

В колбу на 50 мл вносят 5 мл АР-3 нужного элемента. Объем раствора доводят до 50 мл 0.1-молярным раствором HCl. Концентрация полученного раствора составляет 10 мкг/л (0.00001 г/л или 10-6г/л).

Подготовка электродов к работе. Хранение.

1) Хлорсеребряный электрод (электрод сравнения)

Перед эксплуатацией удалить пробку, промыть электрод дистиллированной водой и залить 3.5 М KCl. Выдержать электрод в растворе 3.5 М KCl в течение 48 ч. В процессе работы пробка должна быть удалена. Электрод следует хранить закрытым пробкой, погруженным в 3.5 М раствор KCl.

2) Стеклоуглеродный электрод (вспомогательный)

Хранить в дистиллированной воде.

3) Селективный электрод (рабочий)

После формирования поверхности и измерений хранить в дистиллированной воде.

Приготовление 3.5 М КСl

Для приготовления 1 л 3.5 М КСl необходимо взять 260.75 г КСl, поместить в мерную колбу и довести объем до 1 л. Дистиллированной водой.

Раствор для формирования поверхности электрода V-типа необходим 0.5 М НСl.

0.8 мл 6 М НСl, объем раствора довести до 10 мл дистиллированной водой.

0.2 мл – 200 мкл

0.02 мл – 20 мкл

0.05 мл – 50 мкл

Лаборатории биохимии белка

В период с 23.05.2016 по 10.06.2016 я проходила практику на базе филиала института биоорганической химии имени академиков М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова ФИБХ РАН в городе Пущино. Основными направлениями исследований являются:

- Поиск, выделение, установление строения и синтез новых биологически активных веществ - белков и пептидов. Изучение молекулярных механизмов их действия, взаимосвязи структуры и функции;

- Изучение молекулярных механизмов узнавания биомолекул и передачи сигналов в биологических системах;

- Исследования структуры и функции нуклеиновых кислот - генов человека, животных, растений. Экспрессия генов биологически важных белков;

- Изучение молекулярных и клеточных основ иммунологии - механизмов иммуномодулирующей и противоопухолевой активностей природных и синтетических соединений.

Моя работа проходила в лаборатории биохимии белка под руководством Зинченко Дмитрия Валерьевича и аспирата Владимирова Василия. В течение 3 недель мной были освоены методики работы с автоматическими пипетками «Biohit» и «Eppendorf», электрофорезом «Bioradminiprotein 2», центрифугами настольной «EppendorfminiSpin» и препаративнойBeckman J2-21M, жидкостным хроматографом низкого давления «Pharmacia FPLC system". Проводилась работа по очистке и выделению белков, таких как кавеолин и рековерин. Методом электрофореза в денатурированных условиях (по методике Лемми) было проанализированно более 30 образцов, освоены навыки работы с рекомбинантными белками, изучены теоретические основы жидкостной хроматографии и применены данные навыки при хроматографическом процессе разделения белковых смесей методом гидрофобной и ионообменной хроматографии, были освоены процессы наращивания и индукции биомассы клеток e.coli, а так же процесс трансформации штамма бактериальных клеток e.coli В1-21 DE-3 плазмидной ДНК pET-28a.

Наиболее подробно остановлюсь на описании процесса электрофореза белка.

ЭлектрофорезSDS

Предварительная подготовка: Нужно приготовить буфер 10x для этого необходимо взять 30,3 грамм Trisbase, 144, 0 грамм Глицина, 10 грамм SDS, растворить в объеме 1 литр и разлить в 2 колбы для верхнего и нижнего буфера ( хранить в холодильнике t=+4^о С).

Собрать установку (Рис.6).

Рис.6. Установка для электрофореза

Для проведения электрофореза используется гель двух типов: разделяющий (stakinggel) и концентрирующий(concentratinggel) (Рис.7.).

Рис.7. Состав разделяющего геля для электрофореза

После их получения при помощи пипетки заливать сначала разделяющий гель до отметки и следить, чтобы был ровный уровень. Для убирания пузырей воздуха можно налить сверхуизобутановый спирт и затем его вылить, промыть дистиллированной водой. Затем наливают второй гель и опускают в него гребенку на 10 или 15 ячеек. После полимеризации геля ее нужно вынуть. В это время в установку налить верхний и нижний буферы. В образовавшиеся ячейки при помощи шприца Гамильтона заполнить смесью с sample буфером по 5 мкл в каждую на 35 минут ( состав:30 мклTris, 5 мкл клеточного лизата, 5 мклsample буфера), за это время все опустится, затем вынуть из камеры, поддеть скребком стекла и в зависимости на каком осталось стекле - "отщипнуть" правый или левый уголок, для того, чтобы определить сторону после окрашивания. Вынутый гель перенести в холодную краску кумаси, подождать когда она почти закипит, снять, еще подождать 5 минут, затем слить краску и налить дистиллированную воду и оставить на ночь.

Рис.8.Полимеризующий гель с нанесенным на него белком

Дата добавления: 2018-02-18; просмотров: 1126; Мы поможем в написании вашей работы!

Поделиться с друзьями:

⇐ Предыдущая 123 Следующая ⇒

Мы поможем в написании ваших работ!