Окрашивание азур-эозиновыми красителями
Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Волгоградский государственный медицинский университет» Министерства Здравоохранения Российской Федерации
Кафедра клинической лабораторной диагностики с курсом клинической лабораторной диагностики ФУВ
Реферат на тему:
«Техника приготовления и окраски цитологических препаратов»
Выполнил:
студент 3 курса 3 группы
лечебного факультета
специальности «Медико-профилактическое дело»
Трегубова Л.Ю.
Проверил:
к.м.н., доцент
Загороднева Елена Александровна
Волгоград 2018г.
Оглавление
Методика приготовления мазка. 3
Правила фиксации мазка. 3
Приготовление стекол. 5
Различные окраски. 6
Список литературы.. 15
Методика приготовления мазка.
Необходимой предпосылкой для точной оценки морфологических особенностей клеток в мазке является правильно сделанный, качественно фиксированный, хорошо окрашенный и методологически корректно изученный мазок, поступающий в лабораторию в сопровождении необходимых клинико-инструментальных и анамнестических данных. Невыполнение этих условий ведет к неправильному распределению клеток ткани, неполному выявлению их морфологических особенностей, "пропуску" важной диагностической информации на предметном стекле или отсутствию корригирующей клинической информации и, тем самым, к ошибочной оценке цитологической картины, а значит к неполноценному или ошибочному диагнозу. Если мазки были приготовлены вне лаборатории, то в соответствии с теми же требованиями оценивается их макроскопический вид. Сотрудники лаборатории должны постоянно обучать представителей клинических отделений, участвующих в приготовлении мазков.
|
|
|
Правильно приготовленный мазок из нормальной или патологически измененной ткани должен отвечать следующим условиям:
1. Мазок должен начинаться на 1 см от узкого края предметного стекла и заканчиваться примерно в 1.5 см от другого края предметного; мазок не должен достигать длинного края стекла, между мазком и краем предметного стекла должно оставаться расстояние примерно 0.3 см.
2. Хороший мазок должен быть максимально тонким (максимально приближающимся к однослойному), равномерной толщины (не волнообразным) на всем протяжении.
3. Мазок из осадка жидкого материала (жидкость из серозной полости, смыв из различных органов, содержимое кистозной полости и т.п.) должен заканчиваться у одного из узких краев предметного стекла в виде следа, оставленного как бы тонкой щеткой.
4. Клетки в мазке должны быть равномерно распределены, все участки мазка должны хорошо просматриваться и не содержать "толстые участки", содержащие непросматриваемые (плохо просматриваемые) скопления или комплексы клеток.
|
|
|
Правила фиксации мазка.
Фиксация мазка проводится в соответствии с методикой, обусловленной биологическим материалом, взятым для цитологического исследования (влажная фиксация биологического материала или подсушивание его на воздухе). При влажной фиксации приготовленный мазок помещается в фиксирующую жидкость, затем подсушивается на воздухе. Недостаточная фиксация мазка ведет к некачественному окрашиванию клеток.
1. Правильная фиксация мазка обусловливает стойкость клеток по отношению к содержащейся в красках воде, которая в нефиксированном мазке изменяет строение клеточных элементов. При фиксации мазка происходит коагуляция белка, в результате чего клетки прикрепляются к предметному стеклу;
2. При фиксации цитологических препаратов должны использоваться фиксаторы, прописи приготовления которых приводятся в соответствующих руководствах.
3. Рекомендуемые фиксаторы: - метиловый спирт; - этиловый спирт; - смесь Никифорова; - фиксатор Май-Грюнвальда; - фиксатор Лейшмана; - ацетон (для иммуноцитохимии). Лучшим фиксатором является метиловый спирт, на основе которого готовят фиксатор Лейшмана и Май-Грюнвальда.
|
|
|
Правила окрашивания мазка.
Качественное окрашивание позволяет правильно идентифицировать клеточные элементы мазка и оценить их особенности при микроскопии. В адекватно окрашенном мазке структуры цитоплазмы, ядра, ядерного хроматина, ядрышек окрашены селективно.
1. При применении любой методики окрашивания мазка важно точно соблюдать последовательность процедур приготовления растворов и временные промежутки в течение процесса окрашивания.
2. Существующие в продаже партии красителя имеют различную интенсивность окраски. Это обязывает опытным путем установить оптимальные концентрации (разведение) и время окрашивания для каждого флакона красителя, которые устанавливают при окрашивании серии препаратов растворами с различной концентрацией красителя, меняя длительность его воздействия. При приготовлении растворов необходимо учитывать рН воды: она должна быть нейтральной (pH 6,8 -7,2), что обеспечивается использованием буферных растворов.
3. Рекомендуемые методы окрашивание цитологических мазков: - азур-эозиновый, (по Романовскому, Лейшману, Май-Грюнвальду, Панпенгейму и др.); - гематоксилиновый; - гематоксилин-эозиновый; - метод Папаниколау.
|
|
|
4. Для уточнения диагноза рекомендуется использование цитохимических и иммуноцитохимических методов анализа в соответствии с принятыми методиками.
Приготовление стекол
Стекла для приготовления цитологических препаратов должны быть чистые, обезжиренные и сухие.
1. Стекла тщательно промывают щеткой в теплой мыльной (или с моющим средством) воде.
2. Основательно промывают в проточной теплой воде.
3. Затем кипятят 1-2 часа в воде с добавлением соды (2-3%) или моющего средства.
4. После хорошо ополаскивают в чистой горячей воде и промывают в проточной (1-2 часа).
Обработанные и промытые в воде стекла протирают мягкой тряпкой, держа стекла за края, и хранят в смеси Никифорова (равные части 96° спирта и эфира). По мере надобности пинцетом извлекают стекла из смеси Никифорова и протирают сухой тряпкой. Обработанные таким образом стекла могут быть использованы для приготовления цитологических препаратов.
Для проведения цитохимических исследований очень хорошие результаты дает обработка предметных стекол и других стеклянных предметов в хромовой смеси следующего состава:
Двухромовокислый калий (бихромат калия) - 100 г; вода горячая - 1000 мл; неочищенная серная кислота - 100 мл.
Для приготовления хромовой смеси растворяют в горячей воде двухромовокислый калий, затем охлаждают раствор и после этого добавляют серную кислоту. Кислоту льют осторожно (обязательно в вытяжном шкафу), при этом смесь весьма сильно нагревается и приобретает темно-коричневый цвет. В этом составе предметные стекла и другую стеклянную посуду выдерживают 2-3 дня, а после промывают в проточной воде в течение 1-2 часов.
На хорошо обезжиренном предметном стекле вода должна растекаться тонким слоем, а не собираться в капли.
Для обеспечения надежной маркировки стекол используют механический и химический способы «матирования» края поверхности стекла. Механический способ основан на обработке предметного стекла абразивным камнем на станке. При использовании второго способа в пластмассовый сосуд вместимостью около 300 мл помещают 50 г фторида аммония и 50 мл концентрированной соляной кислоты. Смесь тщательно перемешивают до кашицеобразной консистенции (в вытяжном шкафу). Высота слоя смеси в сосуде не должна превышать 1,5 см. Чистые предметные стекла устанавливают вдоль стенок сосуда таким образом, чтобы один конец стекла был погружен в смесь. В сосуде последовательно размещают 20 - 25 предметных стекол. Через 1 мин стекла переносят на 10-15 мин в пластмассовое ведро с большим количеством воды. Затем воду сливают и стекла обрабатывают слабым раствором серной кислоты (5 мл концентрированной кислоты на 8-10 л воды) для их обезжиривания. После этого стекла тщательно промывают водой и просушивают (можно с помощью вентилятора). Всю работу по подготовке предметных стёкол выполняют в резиновых перчатках. Смесь фторида аммония и концентрированной соляной кислоты можно использовать многократно, добавляя небольшое количество кислоты. Маркировать стекла можно также, подписывая один край стекла тушью.
Различные окраски
Окрашивание азур-эозиновыми красителями
Метод окрашивания по Романовскому (азур-эозиновой смесью) в разных лабораториях используется в разных модификациях – по Паппенгейму (Май-Грюнвельду-Гимзе), Лейшману, Романовскому-Гимзе и т. д. Преимущество метода является четкое прокрашивание ядер, вследствие чего хорошо просматриваются структуры хроматина, а также бактериальная флора и простейшие. краска по Романовскому-Гимзе. Краситель состоит из щелочной части (азур II – ярко-синий цвет), и кислой части (эозин – розово-красный цвет).
В настоящее время используется готовый краситель Романовского-Гимзе, из которого перед началом работы готовят рабочий раствор из расчета 1 капля краски на 1 мл дистиллированной воды.
Высохший фиксированный мазок помещается в кювету с рабочим раствором краски на 25–40 минут (конкретное время устанавливается опытным путем для каждой партии красителя). Бактерии окрашиваются в фиолетово-красный цвет, цитоплазма клеток – в голубой, ядра – в красный. При окрашивании простейших их цитоплазма приобретает голубой цвет, а ядра – красно-фиолетовый. Результаты окрашивания мазков крови:
· Ядра клеток – красно-фиолетовые.
· Эозинофильные гранулы – красновато-коричневые.
· Базофильные гранулы – синие.
· Нейтрофильные гранулы – фиолетовые.
· Цитоплазма лимфоцитов – голубая.
· Эритроциты – бледно-красные.
· Тромбоциты – наружная часть синяя (более светлая); внутренняя – фиолетовая (более темная).
Окраска по Маю-Грюнвальду. Данный метод очень удобен для визуализации гранулоцитов. Для окрашивания применяется готовый раствор эозин-метиленового синего по Маю-Грюнвальду. Мазок без предварительной фиксации заливают красителем, через 5 минут промывают и высушивают.
· Лимфоциты – ядра: сине-фиолетовые; цитоплазма: голубая.
· Моноциты – ядра: сине-фиолетовые; цитоплазма: серо-голубая.
· Гранулоциты – ядра: сине-фиолетовые; гранулы: красные, фиолетовые, темно-синие (зависит от типа).
· Тромбоциты – наружная часть голубая; внутренняя – фиолетовая.
· Эритроциты – розовые.
Окраска по Паппенгейму. Представляет собой комбинацию двух предыдущих методов. Сухие нефиксированные мазки помещаются в кювету с раствором Мая-Грюнвальда на 3–5 минут. После этого контейнер с мазками ополаскивается дистиллированной водой, после чего мазки помещаются в кювету с разведенным раствором Романовского-Гимзы на 20–30 минут. После этого мазки промываются проточной водой и высушиваются.
· Ядра клеток – красно-фиолетовые.
· Цитоплазма лимфоидных клеток – светло-синяя.
· Лимфоидная азурная грануляция – ярко-синяя.
· Миелоидная азурная грануляция – фиолетовая.
· Нейтрофильные гранулы – светло-фиолетовые.
· Эозинофильные гранулы – красные, красно-коричневые.
· Базофильные гранулы – темно-фиолетовые, черные.
· Эритроциты – розовые (полихроматофильные эритроциты - синеватые).
· Тельца Жолли – красновато-фиолетовые.
· Тельца Ауэра – ярко-красные.
Методика окраски по Лейшману. Высушенные на воздухе препараты заливают краской Лейшмана на 3 мин., при этом препарат одновременно фиксируется. После этого промывают водопроводной водой и заливают азур-эозиновой смесью (40 мл 0, 1% азура II и 30 мл 0,1% эозина К) на 15–20 мин. Затем промывают водопроводной водой, высушивают на воздухе и микроскопируют. Используется для выявления малярийных плазмодиев.
Дата добавления: 2021-01-21; просмотров: 1334; Мы поможем в написании вашей работы! |
Мы поможем в написании ваших работ!