Проверка достоверности анализа аллельной дискриминации
Мы проанализировали ДНК от людей с WT и мутантными генотипами на FVL и
Мутации PT G20210A; шесть возможных результатов показаны на рисунках 6.2–6.7.
Человек WT (рисунок 6.2) показывает флуоресцентный сигнал для обоих датчиков WT, но
не для их мутантных аналогов (FVL и PT G20210A). Человек, который
является гомозиготным по одной из двух мутаций (рисунки 6.3 и 6.4), показывает
флуоресцентный сигнал с зондом, комплементарным мутантной последовательности, но не
со своим аналогом WT и другим флуоресцентным сигналом с другим зондом WT
но не со своим аналогом-мутантом. Лица, которые являются гетерозиготными для одного
цель генерирует флуоресцентный сигнал с обоими зондами для этой цели (рис. 6.5
и 6,6). Сложные гетерозиготные особи генерируют флуоресцентные сигналы со всеми
четыре зонда (два зонда WT и два мутантных зонда; см. рис. 6.7).
© 2006 Bio-Rad Laboratories, Inc. Все права защищены . Руководство по применению ПЦР в реальном времени
59
Страница 64 |
генотипирование / аллельная дискриминация
анализ данных аллельной дискриминации
© 2006 Bio-Rad Laboratories, Inc. Все права защищены . Руководство по применению ПЦР в реальном времени
60
Рис. 6.2. WT генотип.
Зонд FVL WT / FAM
PT G20120A WT-зонд / TAMRA
Страница 65 |
генотипирование / аллельная дискриминация
анализ данных аллельной дискриминации
© 2006 Bio-Rad Laboratories, Inc. Все права защищены. Руководство по применению ПЦР в реальном времени
61
Зонд для мутантов FVL / TET
|
|
PT G20210A мутантный зонд / техасский красный
Страница 66 |
генотипирование / аллельная дискриминация
анализ данных аллельной дискриминации
© 2006 Bio-Rad Laboratories, Inc. Все права защищены . Руководство по применению ПЦР в реальном времени
62
Рис. 6.3. Гомозиготный мутант FVL.
Зонд FVL WT / FAM
PT G20120A WT-зонд / TAMRA
Страница 67 |
генотипирование / аллельная дискриминация
анализ данных аллельной дискриминации
© 2006 Bio-Rad Laboratories, Inc. Все права защищены . Руководство по применению ПЦР в реальном времени
63
Зонд для мутантов FVL / TET
PT G20210A мутантный зонд / техасский красный
Страница 68 |
генотипирование / аллельная дискриминация
анализ данных аллельной дискриминации
© 2006 Bio-Rad Laboratories, Inc. Все права защищены . Руководство по применению ПЦР в реальном времени
64
Рис. 6.4. Гомозиготный мутант PT G20210A.
Зонд FVL WT / FAM
PT G20120A WT-зонд / TAMRA
Страница 69 |
генотипирование / аллельная дискриминация
анализ данных аллельной дискриминации
© 2006 Bio-Rad Laboratories, Inc. Все права защищены . Руководство по применению ПЦР в реальном времени
65
Зонд для мутантов FVL / TET
PT G20210A мутантный зонд / техасский красный
Страница 70 |
генотипирование / аллельная дискриминация
анализ данных аллельной дискриминации
© 2006 Bio-Rad Laboratories, Inc. Все права защищены . Руководство по применению ПЦР в реальном времени
|
|
66
Рис. 6.5. Гетерозиготный генотип FVL G1691A.
Зонд FVL WT / FAM
PT G20120A WT-зонд / TAMRA
Страница 71 |
генотипирование / аллельная дискриминация
анализ данных аллельной дискриминации
© 2006 Bio-Rad Laboratories, Inc. Все права защищены . Руководство по применению ПЦР в реальном времени
67
Зонд для мутантов FVL / TET
PT G20210A мутантный зонд / техасский красный
Страница 72 |
генотипирование / аллельная дискриминация
анализ данных аллельной дискриминации
© 2006 Bio-Rad Laboratories, Inc. Все права защищены . Руководство по применению ПЦР в реальном времени
68
Рис. 6.6. Гетерозиготный генотип PT G20210A.
Зонд FVL WT / FAM
PT G20120A WT-зонд / TAMRA
Страница 73 |
генотипирование / аллельная дискриминация
анализ данных аллельной дискриминации
© 2006 Bio-Rad Laboratories, Inc. Все права защищены . Руководство по применению ПЦР в реальном времени
69
Зонд для мутантов FVL / TET
PT G20210A мутантный зонд / техасский красный
Страница 74 |
генотипирование / аллельная дискриминация
анализ данных аллельной дискриминации
© 2006 Bio-Rad Laboratories, Inc. Все права защищены . Руководство по применению ПЦР в реальном времени
70
Рис. 6.7. Соединение гетерозиготного генотипа FVL и PT G20210A.
Зонд FVL WT / FAM
|
|
PT G20120A WT-зонд / TAMRA
Страница 75 |
генотипирование / аллельная дискриминация
анализ данных аллельной дискриминации
© 2006 Bio-Rad Laboratories, Inc. Все права защищены . Руководство по применению ПЦР в реальном времени
71
Зонд для мутантов FVL / TET
PT G20210A мутантный зонд / техасский красный
Страница 76 |
генотипирование / аллельная дискриминация
анализ данных аллельной дискриминации
© 2006 Bio-Rad Laboratories, Inc. Все права защищены . Руководство по применению ПЦР в реальном времени
72
Чтобы изучить воспроизводимость четырехцветного анализа, шесть образцов ДНК из
особи с известными генотипами (WT, гомозиготный мутант FVL, PT G20210A
гомозиготный мутант, FVL гетерозиготный, PT G20210A, гетерозиготный, и FVL / PT
Соединение G20210A (гетерозиготное) и контроль без матрицы были протестированы в пяти
эксперименты. Во всех случаях анализы образцов давали
однозначные генотипы.
Присвоение генотипа
Генотипы могут быть назначены путем анализа графиков амплификации, сгенерированных для каждого
аллель-специфический зонд или с помощью доступного модуля анализа аллельной дискриминации
в программном обеспечении многих инструментов реального времени, включая iCycler iQ, DNA Engine
Системы Opticon ® 2, Chromo4 и iQ5 (см. Руководство по продукту). После
|
|
усиление ПЦР в реальном времени завершено, iCycler iQ, iQ5 и Opticon Monitor ™
программные пакеты могут назначать генотипы, используя алгоритм, который учитывает
учитывать сигнал от назначенных WT и гомозиготных мутантных контролей. Эти
программные пакеты могут анализировать либо конечные относительные флуоресцентные единицы (RFU), либо
Значения C T и график данных в виде точечной диаграммы.
Для многоцветного мультиплексного анализа, описанного здесь, генотипы для каждого гена были
назначается программным обеспечением iCycler iQ в режиме RFU и отображается на
отдельные участки. На рисунке 6.8 показаны генотипы для коагуляции.
ген фактора V, с четырьмя четко определенными кластерами, показанными на графике. Первый кластер
состоит из выборок со значениями сигнала FAM (ось x) в пределах 1050–1700 RFU и
представляет людей с генотипом WT. Второй кластер включает в себя образцы
со значениями сигнала TET (ось Y) в пределах 1000–1600 RFU и представляет отдельных лиц
Рис. 6.8. Генотипирование фактора свертывания крови V с помощью многоцветного мультиплексного анализа TaqMan.
Показаны нормированные значения флуоресценции FAM (зонд WT) в сравнении с TET (зонд мутанта FVL).
Страница 77 |
генотипирование / аллельная дискриминация
анализ данных аллельной дискриминации
© 2006 Bio-Rad Laboratories, Inc. Все права защищены . Руководство по применению ПЦР в реальном времени
73
Рис. 6.9. Генотипирование PT с помощью многоцветного мультиплексного анализа TaqMan. Нормализованная флуоресценция
показаны значения TAMRA (зонд WT) и техасского красного (зонд мутанта PT).
с гомозиготным мутантным генотипом FVL. Третий кластер (FVL гетерозиготный
физические лица) включает образцы со значениями сигналов FAM и TET в пределах 300–1100
РФС. Последний кластер представляет выборки с очень низкими значениями RFU для обоих FAM
и ТЕТ; это элементы управления без шаблонов. Аналогично, на рисунке 6.9 показан PT
генотипы в четырех четко определенных кластерах. Результаты генотипирования, полученные
мультиплексный четырехцветный анализ и анализ с помощью программного обеспечения были в согласии с
результаты анализа генотипирования RFLP (данные не показаны).
Страница 78 |
© 2006 Bio-Rad Laboratories, Inc. Все права защищены . Руководство по применению ПЦР в реальном времени
74
Страница 79 |
Генетически модифицированный
Организм (ГМО)
обнаружение
Экспериментальная дизайн
77
Дата добавления: 2020-04-08; просмотров: 103; Мы поможем в написании вашей работы! |
Мы поможем в написании ваших работ!