Проектирование праймеров и ампликонов

⇐ ПредыдущаяСтр 5 из 16Следующая ⇒

Успешная реакция ПЦР в реальном времени требует эффективного и специфического усиления

продукт. И праймеры, и последовательность-мишень могут влиять на эту эффективность. Следовательно,

Будьте внимательны при выборе целевой последовательности и разработке праймеров.

для этого доступно множество бесплатных и коммерчески доступных программ

цель. Primer3 - одна из популярных веб-программ для начинающих.

http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi ). Коммерчески

Доступная программа, такая как программное обеспечение Beacon Designer, выполняет оба проекта:

и выбор ампликона.

Для разработки ампликона следуйте этим рекомендациям:

• Дизайн ампликона должен быть 75–200 б.п. Более короткие ампликоны обычно усиливаются

более высокая эффективность. Ампликон должен быть не менее 75 п.н., чтобы его можно было легко отличить

от любых праймеров-димеров, которые могут образовывать

• Избегайте вторичной структуры, если это возможно. Используйте такие программы, как mfold

http://www.bioinfo.rpi.edu/applications/mfold/ ), чтобы предсказать,

ампликон образует любую вторичную структуру при температуре отжига. Смотрите реальный

Time PCR: общие соображения (бюллетень Bio-Rad 2593) для более подробной информации

• Избегайте шаблонов с длинными (> 4) повторениями отдельных баз

• Поддерживать содержание ГХ 50–60%

Для разработки грунтовки, выполните следующие параметры:

• Разработка грунтовок с содержанием ГХ 50–60%.

• Поддерживайте температуру плавления (T m ) от 50 ° C до 65 ° C. Мы рассчитываем Т м

значения с использованием метода ближайшего соседа со значениями 50 мМ для соли

концентрация и 300 нМ для концентрации олигонуклеотидов

• избегать вторичной структуры; скорректировать расположение праймеров вне целевой последовательности

вторичная структура, если требуется

Страница 24

начиная

разработка и оптимизация реакций SYBR Green I

• Избегайте повторов G или C длиннее трех оснований

• Поместите G и C на концах праймеров.

• Проверьте последовательность прямого и обратного праймеров, чтобы убедиться в отсутствии 3 'комплементарности.

(избегайте образования праймер-димер)

• Проверить специфичность с помощью таких инструментов, как инструмент поиска базового локального выравнивания

( http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/ )

Проверка достоверности и оптимизация

QPCR-реакция SYBR Green I содержит следующие компоненты:

• Мастер-микс для ПЦР с SYBR Green I

• шаблон

• учебники для начинающих

Готовые смеси ПЦР в реальном времени, содержащие буфер, ДНК-полимеразу,

dNTP и краситель SYBR Green I доступны от нескольких поставщиков. Мы рекомендуем

Супермикс iQ ™ SYBR ® Green.

Оптимизированные QPCR-реакции SYBR Green I должны быть чувствительными и специфичными и

должен демонстрировать хорошую эффективность усиления в широком динамическом диапазоне. к

определить эффективность вашего анализа SYPR Green I КПЦР, выполнить

следующие два шага:

• Определите оптимальную температуру отжига для вашего анализа

• Построить стандартную кривую для оценки эффективности анализа

Оптимизация температуры отжига

Оптимальная температура отжига может быть легко оценена на приборах КПЦР

которые имеют функцию градиента температуры, такие как MiniOpticon ™ , MyiQ ™ ,

Системы DNA Engine Opticon ® , Opticon ™ 2, iCycler iQ ® , Chromo4 ™ и iQ ™ 5.

Функция градиента позволяет вам тестировать диапазон температур отжига

одновременно, поэтому оптимизационные реакции могут быть выполнены в одном эксперименте.

Чтобы найти оптимальную температуру отжига для вашей реакции, мы рекомендуем провести тестирование

диапазон температур отжига выше и ниже расчетной T m праймеров.

Пример эксперимента по оптимизации температуры отжига показан на рисунке 2.11.

Поскольку SYBR Green I связывается со всеми дцДНК, необходимо проверить специфичность

вашего анализа КПЦР путем анализа продукта (ов) реакции. Для этого используйте расплав-

функция кривой на вашем приборе в реальном времени, а также запускать продукты на агарозе

гель. Рисунок 2.12 показывает анализ кривой плавления и анализа агарозного геля после отжига.

Оптимизация температуры эксперимента показана на рисунке 2.11. Реакция с

температура отжига при 62,2 ° С. Оптимизированный SYBR Green I qPCR

реакция должна иметь один пик на кривой расплава, соответствующий единственному

полоса на агарозном геле, как показано на рисунке 2.12.

Страница 25

начиная

разработка и оптимизация реакций SYBR Green I

Неспецифические продукты, которые могли быть объединены с конкретным продуктом

можно определить с помощью анализа кривой плавления (рис. 2.13). В этом примере конкретный

продукт представляет собой пик с Т м 89 ° С и соответствует верхней полосе на

гель. Неспецифический продукт представляет собой пик с Т м 78 ° С и соответствует

Нижняя полоса в геле. Сравнивая изображение геля с кривой расплава, вы можете

определить пики на кривой расплава, которые соответствуют конкретному продукту, дополнительные

неспецифические полосы и праймеры-димеры. Если неспецифические продукты, такие как грунтовка

димеры обнаруживаются с помощью анализа кривой плавления, мы рекомендуем вам перепроектировать

ваши праймеры (см. раздел 2.3.1).

Рис. 2.12. Валидация реакций SYBR Green I. А, анализ кривой плавления, с первой производной от

изменение интенсивности флуоресценции в зависимости от функции температуры и B, анализ агарозного геля

продукты реакции. Дорожка 1, маркеры молекулярной массы, 100–1000 п.н. с шагом 100 п.н., 1200 и

1500 п.н .; дорожка 2, одиночный продукт ПЦР, соответствующий пику, наблюдаемому в (А).

Рис. 2.11. Оптимизация температуры отжига. Градиент температуры отжига от 55 ° C до 72 ° C был

выполняется в системе Chromo4. Реакция 62,2 ° С дала самое низкое значение С Т и была выбрана в качестве

оптимальная температура отжига для этого анализа.

цикл

лу

ре

температура

лу

ре

0,25

62,2 ° С

69,4 ° С

55,0 ° С

72,0 ° С

Страница 26

начиная

разработка и оптимизация реакций SYBR Green I

Дата добавления: 2020-04-08; просмотров: 168; Мы поможем в написании вашей работы!

Поделиться с друзьями:

⇐ Предыдущая 1 2 3 456 7 8 9 10 Следующая ⇒

Мы поможем в написании ваших работ!