Молекулярно-генетические методы определения ЛУ
Генотипические методы определения ЛУ МБТ основаны на выявлении специфических мутаций, связанных с резистентностью к определенным ПТП. Основным преимуществом МГМ является быстрое и достоверное выявление больных МЛУ-ТБ, так как они позволяют выявить ЛУ МБТ к рифампицину и изониазиду, а также к важнейшим препаратам второго ряда, позволяя использовать разделение потоков больных и включать в режим лечения наиболее эффективные препараты.
Молекулярно-генетические тест-системы на определение ЛУ представлены тремя основными технологиями:
1) гибридизационные технологии, основанные на гибридизации продуктов ПЦР со специфическими олигонуклеотидами, иммобилизированными на матрице, которая может представлять собой биологический микрочип, или ДНК-стрип
2) мультиплексная ПЦР в режиме реального времени
3) «картриджная» технология (выделение ДНК и амплификация идут автоматически в специальном картридже)
Гибридизационные технологии. Гибридизационные технологии позволяют в культуре с плотной или жидкой питательной среды или непосредственно в мокроте в течение 1-2 дней выявлять наиболее распространенные мутации в генах МБТ, связанных с устойчивостью к основным ПТП первого ряда – изониазиду и рифампицину и некоторым ПТП второго ряда (в зависимости от тест-системы). Данная группа методов основана на том, что амплифицированные в результате ПЦР целевые последовательности гибридизуются с зондами, нанесенными на соответствующую матрицу. По результатам гибридизации делается вывод о наличии мутаций, приводящих к устойчивости к ПТП.
|
|
|
Биологические микрочипы. В настоящее время на территории РФ зарегистрированы две отечественные тест-системы, использующие микрочиповую технологию: «ТБ-Биочип», которая позволяет определять ЛУ к рифампицину и изониазиду (гены rpoB, katG, inhA, ahpC) с чувствительностью метода более 95% при установлении устойчивости к рифампицину и более 85% – к изониазиду (специфичность 95%), и «ТБ-Биочип-2», позволяющая определять устойчивость к фторхинолонам с чувствительностью не менее 85% (ген gyrA).
ДНК-стрипы. Метод позволяет определять ЛУ к рифампицину, изониазиду, фторхинолонам, этамбутолу, аминогликозидам/циклическим пептидам.Метод основан на множественной обратной гибридизации на ДНК-стрипах и лежит в основе тест-системы GenoType MTBDRplus, применяемой для определения ЛЧ к изониазиду и рифампицину, и тест-системы GenoType MTBDRsl для определения ЛУ к фторхинолонам, аминогликозидам/циклическим пептидам и этамбутолу.После одноэтапной амплификации со специфическими праймерами продукты ПЦР гибридизуются с олигонуклеотидами, иммобилизованными на стрипах. Гибридизация ампликонов проходит в открытых ванночках, что увеличивает риск контаминации. Результат гибридизации визуализируется на нейлоновой мембране – стрипе в виде набора полос, которые вручную или с помощью прибора сравнивают с шаблоном и определяют наличие мутаций, ассоциированных с ЛУ. Чувствительность и специфичность набора GenoType MTBDRplus, по данным метаанализа публикаций группы экспертов ВОЗ, высоки и составляют 98,1 и 98,7% для рифампицина и 84,3 и 99,5% для изониазида соответственно. Специфичность набора GenoType MTBDRsl, по данным метаанализа публи- каций группы экспертов ВОЗ, для ПТП второго ряда превышает 95%, а чув-ствительность при определении устойчивости к фторхинолонам составляет 83,5%, а для канамицина, амикацина и капреомицина – около 95%. При определении устойчивости к этамбутолу были показаны более низкая чувствительность и специфичность – 56 и 81% соответственно.
|
|
|
Мультиплексная ПЦР в режиме реального времени. Метод ПЦР в режиме реального времени позволяет определять мутации, ассоциированные с ЛУ к рифампицину, изониазиду (АМПЛИТУБ-МЛУ-РВ).Преимуществом данного метода перед вышеописанными технологиями является отсутствие этапа гибридизации и оценка результатов в режиме реального времени, что позволяет снизить возможность контаминации. Использование зарегистрированных наборов позволяет с высокой чувствительностью и специфичностью (94 и 99% соответственно) выявлять мутации в генах rpoB, katG и inhA, ассоциирующиеся с устойчивостью к рифампицину и изониазиду
Картриджная технология. Использование системы GeneXpert MTB/RIF позволяет непосредственно из нативной мокроты в очень короткие сроки (в течение 2,5 ч) одновременно проводить выявление ДНК МБТ и с высокой достоверностью определять устойчивость МБТ к рифампицину.
Дата добавления: 2020-01-07; просмотров: 232; Мы поможем в написании вашей работы! |
Мы поможем в написании ваших работ!