Зарисовать схему молекулярной гибридизации (МГ)
Метод молекулярной гибридизации ДНК-ДНК используется для установления геномного родства в пределах рода и семейств микроорганизмов; РНК-ДНК на уровне порядка. Степень сходства или гомологичность последовательностей ДНК выражается процентом (%) гомологии и является мерой геномного родства микроорганизмов.
Схема точечной гибридизации
- ДНК наиболее типичного штамма метится изотопом 3H тритием или 32P фосфором
- Фрагментация и денатурация меченой ДНК
- Исследуемая ДНК денатурируется, но не фрагментируется и иммобилизуется на твердой фазе, например на гранулированном агаре, мембранных фильтрах (нитроцеллюлозные или нейлоновые)
- Инкубация исследуемой ДНК с меченой ДНК в жидкой среде. При гомологии фрагменты меченой гибридизируются с исследуемой, т.е. формируется двунитчатая структура
- Для повышения точности метода применяют обработку гибридов специфическим ферментом – нуклеазой S1, которая способна «отсеивать» от гибридных дублексов непрореагировавшие одноцепочечные участки
- Отделение гибридов с помощью гидроксиаппатита, т.е. отмывка гибридов от балластного материала
- Подсчет радиактивности на счетчиках с определением % гомологии ДНК
Недостаток метода - короткий период полураспада фосфора и наличие специфического оборудования.
Блот-гибридизация
Метод выявления фрагментов ДНК, разделенных электрофорезом в агарозе. ДНК предварительно нарезается с помощью рестрикционных эндонуклеаз из суммарной ДНК. Перенос фрагментов ДНК на нитроцеллюлозные фильтры и обработка мечеными зондами.
|
|
|
Гибридизация in situ
Позволяет выявить нуклеиновые кислоты в инфицированных клетках. Клетки, после денатурации нуклеиновой кислоты, обрабатываются немечеными зондами, формирующими гибридные двунитчатые структуры, затем обработка меченой флюорохромом сывороткой к гибридомам. При наличии в материале незначительных количеств нуклеиновой кислоты вирусов применяется ПЦР.
Зарисовать схему постановки полимеразной цепной реакции (ПЦР) ( см. базовый текст)
Схема цикла амплификации (многократного увеличения числа копий специфического
Фрагмента участка ДНК)
1. Денатурация (разрыв водородных связей и трансформация двухцепочечной ДНК в одноцепочечные) осуществляется при температуре 93-95ºC в течение 1-3 минут
2. Присоединение (отжиг) праймеров (олигонуклеоитидные генетические затравки) происходит комплементарно к соответствующим последовательностям специфического фрагмента на противоположных нитях ДНК. Температура отжига является специфической для каждой пары праймеров и располагается в интервале 50-65ºC. Точно рассчитанная и экспериментально проверенная величина температуры отжига праймеров является одной из определяющих специфичность реакции характеристик, исключающих присоединение праймеров к не полностью комплементарным последовательностям.
|
|
|
3. Комплементарное достраивание цепей ДНК (синтез фрагмента). Присоединившиеся праймеры формируют стартовые блоки, с которых начинается синтез ДНК. Комплементарное достраивание нитей ДНК всегда протекает только в направлении от 5'-конца к 3'- концу нити ДНК и происходит в противоположных друг другу направлениях. Образовавшиеся в первом цикле амплификации продукты синтеза служат матрицами для второго цикла амплификации, в результате которого, собственно, и происходит накопление искомого специфического фрагмента ДНК. Начиная с третьего цикла амплификации вновь синтезированные фрагменты ДНК служат в качестве матрицы для синтеза новых нитей в следующем цикле амплификации – это и есть цепная реакция в ПЦР. Температура синтеза ДНК 72 ºC, время -3 мин.
Построение новых нитей ДНК из дезоксирибонуклеотидтрифосфатов (дНТФ) осуществляет термостабильная ДНК-полимераза, т.н. Taq-полимераза в присутствии ионов магния и трис- HCl – буфера, которые создают необходимые условия для функционирования фермента.
|
|
|
В результате 30-45 циклов амплификации синтезируются 108 копий фрагмента, что делает возможным визуальный учет результатов после электрофореза в агаровом (полиакриламидном) геле. Использование термостабильной ДНК-полимеразы позволило автоматизировать процесс амплификации с помощью специального прибора, называемого термоциклером или амплификатором. Этот прибор автоматически осуществляет смену температур согласно заданной программе и числу циклов амплификации.
Дата добавления: 2019-09-13; просмотров: 343; Мы поможем в написании вашей работы! |
Мы поможем в написании ваших работ!