Властивості виробничого штаму ВК–1М ВД

Показники		Необхідні параметри
		матраси	бутлі
Оптимальна доза зараження	співвідношення об’єму вірусу й підтримуючого середовища	1:20	1:30
Інфекційна активність вірусу в заражаючій дозі	ТЦД 50/см3	1000	1000
Множинність зараження	ТЦД50/клітину	0,01	0,01
Час репродукції в моношаровій культурі клітин КСТ за ролерного культивування	годин	40	40
Титр інфекційності вихідної сировини	lg ТЦД 50/см3	6,6	7,6

 

Після відпрацювання технології культивування й накопичення біомаси вірусу діареї ми здійснили дослідження щодо її звільнення від клітинного детриту.

Як засвідчили результати цих досліджень, виконаних на моделі штаму ВК–1М вірусу діареї, осадження клітинного детриту за методом спонтанної седиментації й центрифугування за 2500 g упродовж 30–ти хвилин забезпечувало відповідно отримання прозорої вірусовміщуючої рідини на 34–35 і 44–45 % порівняно з дистильованою водою (табл. 2).

У той же час очистка не впливала на інфекційну активність вірусу, яка залишалася фактично на одному рівні як до, так і після видалення клітинного детриту шляхом седиментації та центрифугування, й становила відповідно 7,55 і 7,6 lg ТЦД ₅₀/см³.

Таблиця 2

Порівняльна оцінка способів очистки вірусу діареї M±n, n=3

Спосіб очистки	Ступінь очистки за прозорістю,%	Кількість білка, мкг/см3		Титр інфекційності, lg ТЦД50/см3
		до очистки	після очистки	до очистки	після очистки
Седиментація	34–35	2185	1845	7,60±0,15	7,55±0,25
Центрифугування	44–45	2185	1148	7,60±0,15	7,60±0,10

 

Однак отримані дані свідчать про те, що центрифугування за 2500 g протягом 30‑ти хвилин сприяє більш швидкому та ефективному очищенню вірусовмісної суспензії від клітинного детриту й загального білка, на підставі чого в подальшому застосовували цей метод під час виготовлення дослідних зразків живої вакцини проти вірусної діареї, хоча цей спосіб є більш затратним порівняно із седиментацією, що впливає на собівартість препарату.

Вивчення антигенних властивостей виробничого штаму ВК–1М вірусу діареї. Відомо, що в процесі конструювання вакцинних препаратів на основі атенуйованих штамів вірусу важливим є визначення їхніх антигенних властивостей. Здатність атенуйованого штаму ВК-1М вірусу діареї, обраного нами як виробничий, індукувати в організмі тварин вірусоспецифічні антитіла вивчалась у порівняльному аспекті із штамами 25 і Oregon C 24 V як можливими компонентами для створення вакцини. Дослід здійснено на кроликах, які були сформовані в групи по 5 голів з розрахунку на штам вірусу діареї, який вводили одноразово внутрішньом’язово у відповідній дозі, а саме: Oregon C 24 V – 2Ч10^5,7 і 2Ч10⁷ ТЦД₅₀/гол., 25 – 2Ч10^5,7 і 2Ч10⁷ ТЦД₅₀/гол. і ВК-1М – 2Ч10^6,6 і 2Ч10^7,6 ТЦД₅₀/гол. відповідно першого та п’ятого їх пасажів у культурі клітин.

Установлено, що як у першому, так і в п’ятому пасажах у культурі перещеплюваних клітин КСТ досліджувані штами зберігають здатність індукувати в організмі кроликів вірусонейтралізуючі антитіла, які виявлялися вже на 7 добу після введення та фактично утримувалися на одному рівні до 14 доби (термін спостереження) у титрах 6,0–6,7 lоg₂ і 6,3–6,8 lоg₂. Отримані дані свідчать про антигенну стабільність досліджуваних штамів, зокрема атенуйованого штаму ВК‑1М, як у процесі адаптації до нових умов культивування, так і в пасажах у перещеплюваній культурі клітин КСТ.

Конструювання живої вакцини проти вірусної діареї великої рогатої худоби. Для виготовлення вакцини використовували культуральну суспензію, отриману в результаті репродукції штаму ВК–1М вірусу діареї в моношаровій культурі клітин КСТ, вирощеній у ролерних 3-літрових бутлях. Після одноразового заморожування – відтавання вірусовміщуючу суспензію центрифугували 30 хвилин за 2500 g для видалення клітинного детриту й визначали інфекційний титр шляхом зараження моношарової культури клітин десятикратними розведеннями вірусу. Титр інфекційної активності вірусу в цій культурі був на рівні 7,6 ± 0,1 lg ТЦД₅₀/см³.

Нами було виготовлено два дослідних зразки вакцини, один з яких був висушений методом ліофілізації в умовах ННЦ «ІЕКВМ». У процесі виготовлення ліофілізованого зразка вакцини використовували захисне середовище, яке готували з рівних об’ємів 50 % сахарози і 25 % желатину, після змішування яких із вірусовміщуючою культуральною суспензією у співвідношенні 1:9 кінцева концентрація становила 5,6 % і 2,8 %, відповідно. Під час вивчення інфекційної активності встановлено, що в процесі ліофілізації вона зменшувалася на 2,15 lg ТЦД₅₀/см³ порівняно з вихідним показником (табл. 3). Проте антигенна активність вірусу не змінювалася. Титри вірусонейтралізуючих антитіл у пробах сироватки крові, відібраної у кроликів через 7 і 14 діб після щеплення досліджуваних зразків рідкої та сухої вакцин, були фактично однаковими (6,5 ± 0,2 і 6,3 ± 0,3 log₂).

Таблиця 3

Вплив ліофілізації вакцини на інфекційність та антигенну активність вакцинного вірусу діареїn=3

Зразок вакцини	Титр інфекційності, lg ТЦД50/см3	Титр ВН-антитіл, log2(М±м)
		7 діб	14 діб
Рідка (нативна)	7,6±0,1	6,2±0,1	6,5±0,2
Ліофілізована	5,45±0,3	6,0±0,2	6,3±0,3

 

Вивчення вакцини за показниками якості. Кожний зразок вакцини (рідкої і сухої) проти ВД ВРХ перевіряли на контамінацію сторонніми мікроорганізмами, нешкідливість, антигенну та імуногенну активність. Контроль на контамінацію бактеріями та грибами здійснювали відповідно до ГОСТ 28085-89 «Препараты биологические. Метод контроля стерильности» та згідно з ДСТУ 4483:2005 «Препарати ветеринарні імунобіологічні. Методи визначення бактеріальної і грибкової контамінації». Проростів у вигляді помутніння, змін кольору або газоутворення в інокульованих бактеріологічних середовищах не спостерігали у всіх трьох послідовних пасажах досліджуваних проб, що свідчило про відсутність забрудненості бактеріями й грибами. Контамінацію досліджуваних зразків вакцини мікоплазмами виключали за результатами висівів у середовище Едварда. У трьох послідовних пересівах кожного зразка вакцини в напіврідкому агарі не виявлено завислих, напівпрозорих, у вигляді крапель, а на напівтвердому агарі - росту випуклих соскоподібних колоній мікоплазм.

З урахуванням вимог Європейських стандартів здійснювали контроль вакцини на контамінацію сторонніми вірусами. Відсутність ЦПД у моношаровій культурі клітин у трьох послідовних пасажах суміші вірусу діареї й специфічної сироватки крові вказувало на те, що дослідні зразки були вільними від сторонніх цитопатогенних вірусів.

Нецитопатогенні віруси визначали за методом гемадсорбції. У жодному випадку не спостерігали адсорбцію еритроцитів морської свинки на моношарі клітин, які попередньо інокулювали сумішшю вакцини й специфічної до вірусу діареї сироватки крові.

Отже, розроблена технологія забезпечувала накопичення вихідної вірусовміщуючої культуральної суспензії з високою інфекційністю та виготовлення сухої форми вакцини, не контамінованих сторонніми мікроорганізмами.

Вивчення реактогенності вакцини. Реактогенність виготовлених зразків вакцини проти вірусної діареї, виготовлених із штаму ВК-1М, вивчали в дослідах на кроликах. Зразки середніх проб рідкої та сухої культуральної вакцин вводили підшкірно в об’ємі 2 мл, що відповідало 2Ч10^7,6 і 2Ч10^5,45 ТЦД₅₀/гол., дворазово з інтервалом у 14 діб. У кроликів, щеплених сухим зразком вакцини із штаму ВК-1М і вірусовміщуючою культуральною суспензією штамів 25, Oregon C 24 V, не спостерігали відхилень від нормального клініко-фізіологічного стану, температура тіла була в межах норми.

За результатами гематологічних досліджень у тварин, яким вводили культуральну суспензію штамів 25 і Oregon C 24 V, установлено деяке зниження кількості лейкоцитів у межах 0,5–0,6 тисяч/мм³, а починаючи від 14 доби вона поступово поновлювалась і на 24 добу після щеплення сухої вакцини чи то вірусовміщуючої суспензії досліджуваних штамів 25 і Oregon C 24 V досягала вихідних показників.

Збільшення кількості нейтрофілів супроводжувалося підсиленням фагоцитарної реакції у кроликів у перші доби і її зменшенням та послабленням фагоцитарної реакції на 7–14 доби після щеплення сухого зразка вакцини із штаму ВК–1М і вірусовміщуючої культуральної суспензії штамів 25 і Oregon C 24 V.

У кроликів, яким щепили сухий зразок вакцини проти вірусної діареї зі штаму ВК‑1М, ці показники були виражені менше. Фагоцитарне число та фагоцитарний індекс у цих тварин знижувалися лише на 4,4 % і 0,4 одиниці порівняно з вихідними показниками, що свідчить про слабко виражену реактогенність вакцини з атенуйованого штаму ВК–1М вірусу діареї, тим більше, що він не призводив до проявлення вираженої лейкопенії.

Перевірка нешкідливості сухого зразка вакцини проти вірусної діареї. Нешкідливість вакцини культуральної живої проти вірусної діареї перевірялася на білих мишах і серонегативних до вірусу діареї телятах. Установлено, що вона нешкідлива для піддослідних тварин, у яких у місцях введення препарату не виявлено набряку, припухлості, затвердіння тканин або болісної реакції при пальпації. За підшкірного введення білим мишам вакцини в дозі 0,2Ч10^5,45ТЦД₅₀/гол. під час спостереження впродовж 14 діб (інтервал між дворазовим щепленням вакцини) не спостерігали відхилення у їх загальному стані. У той же час у телят 5‑кратна доза (10Ч10^5,45 ТЦД₅₀/гол.) вакцинного вірусу викликала незначне зниження кількості лейкоцитів. Зокрема, у теляти, в якого було виявлено одноразове підвищення температури тіла (на другу добу увечері) на 1 °С, кількість лейкоцитів понизилась від 7180±96 до 6685±114 кл./мм³ (на 495 кл./мм³), а в теляти, в якого не встановлено температурної реакції, від 7768±123 до 7463±110 (на 305 кл./мм³), що підтверджує слабку реактогенність вакцинного вірусу.

Перевірка антигенної активності вакцини. Антигенну активність сухого зразка вакцини вивчали на кроликах, з яких формували 3 групи по 5 голів у кожній. Вакцину вводили одноразово в дозах 2Ч10^5,45ТЦД₅₀/гол. і 5Ч10^5,45ТЦД₅₀/гол. внутрішньом’язово кроликам першої та другої груп відповідно. А третя група залишалась інтактним контролем.

Установлено залежність рівня продукованих вірусонейтралізуючих антитіл від дози (об’єму) щепленої вакцини. Так, у кроликів другої групи, яким вводилася вакцина в дозі 5Ч10^5,45 ТЦД₅₀/гол., титр вірусоспецифічних антитіл уже на 7 добу був вищим на 1,0 log₂ порівняно з показниками у тварин, щеплених вакциною в дозі 2Ч10^5,45ТЦД₅₀/гол., хоча в подальшому процесі імунної відповіді титри антитіл до вакцинного вірусу діареї фактично вирівнювалися. На підставі отриманих даних зроблено висновок, що досліджуваний зразок сухої вакцини є антигенно активним.

Вивчення імуногенних властивостей вакцини живої проти вірусної діареї. Як повідомляють Сюрин В. Н. із співавт. (1983), ІРТ, ПГ–3 і ВД з характерними клінічними ознаками неможливо відтворити в експерименті в лабораторних умовах. У зв’язку з цим імуногенність, а також захисні властивості вакцинних препаратів прийнято оцінювати за їхньою антигенною активністю. На підставі зазначеного ми вивчали показники специфічного та неспецифічного імунітетів у щеплених вакциною тварин. На першому етапі цих досліджень зразки вакцини були випробувані на морських свинках, для чого було сформовано 4 групи по 10 голів у кожній. У процесі вивчення імуногенної активності вакцини, виготовленої з атенуйованого штаму ВК‑1М ВД ВРХ, на морських свинках підтверджено високу антигенність. Вакцина викликала активну індукцію специфічних вірусонейтралізуючих антитіл. У той же час вакцина у випробуваних дозах була нешкідливою для морських свинок, серед яких не спостерігали захворювання або загибелі. У морських свинок вже на 7 добу після введення вакцини в дозах 0,5 і 1,0 см³ одно- і дворазово титр вірусонейтралізуючих антитіл був на рівні 4,33; 5,75 і 5,5 log₂, поступово зростаючи на 14 добу до 5,45; 6,7 і 5,75 log₂ відповідно. Після повторного введення вакцини спостерігали подальше зростання титрів вірусонейтралізуючих антитіл до 6,4 і 7,3 log₂ відповідно, у той час як після одноразового введення їх титр фактично залишався на попередньому рівні (5,8 log₂).

На підставі отриманих результатів з визначення антигенної активності сухого зразка вакцини на кроликах та вивчення імуногенної активності вакцини на морських свинках була підтверджена значущість дози і необхідність дворазового застосування вакцини живої проти ВД, що сприяло підвищенню титрів вірусонейтралізуючих антитіл. Отримані позитивні результати щодо нешкідливості та імуногенності для лабораторних тварин дозволили нам здійснити її випробування на сприйнятливих до вірусної діареї тваринах в умовах неблагополучного господарства. Враховуючи ті обставини, що вірус діареї є досить потужним імуносупресором і в організмі здатний пригнічувати імунологічну реактивність, перед тим, як застосувати вакцину живу проти ВД на ВРХ, ми випробували імуномодулятор з культури Bacіllus alvei.

Вивчення імуномоделюючої активності ліпополісахариду з Bac. аlvei. Як відомо, бактеріальні ліпополісахариди є поліклональними активаторами В-системи лімфоцитів (Карпуть І. М., 1993) і суттєво стимулюють неспецифічні гуморальні та клітинні ланки імунної системи (Дранкин Г. Н. и др., 1994). А якщо взяти до уваги, що фактично більша кількість скотарських господарств є неблагополучними щодо вірусної діареї, то під час застосування живої вакцини, хоча і з атенуйованого штаму, на можливо інфікованому поголів’ї не виключаються випадки біотичної взаємодії вакцинного та епізоотичного штамів вірусу і негативний вплив утворених рекомбінацій вірусу на імунну систему щеплених тварин. З урахуванням цих обставин, а також з метою пом’якшення імуносупресивної дії вірусу діареї ми використали ліпополісахарид з культури Bacіllus alvei.

Токсичність бактеріального ліпополісахариду визначали на білих мишах (по 10 голів на пробу), яким перорально вводили 0,5 см³ (162,5 мг ЛПС–1), 1 см³ (325 мг ЛПС‑1) і 2 см³ (650 мг ЛПС‑1), що становило відповідно 8,125; 16,25 і 32,5 мг/г маси тіла миші. Під час нагляду впродовж 10 діб не було виявлено змін у загальному стані піддослідних мишей, у тому числі й контрольної групи. У групі мишей, яким підшкірно вводили 0,5 мл ЛПС–1, у місцях ін’єкцій препарату не спостерігали ні набряків, ні інших локальних змін. Отримані результати засвідчили, що виготовлений ЛПС‑1 нетоксичний як за перорального, так і підшкірного введення тваринам, у яких не встановлено клініко-фізіологічних порушень у загальному стані. Миші залишалися здоровими. На підставі цих даних було проведено дослід на кроликах з метою вивчення імуномоделюючих властивостей ЛПС-1, результати якого оцінювали за трансформацією та функціональною активністю мононуклеарних попередників макрофагів, зокрема макрофагальною трансформацією мононуклеарів периферичної крові, показниками фагоцитарного індексу та фагоцитарного числа. Установлено, що ЛПС‑1 здатний підвищувати трансформативну активність попередників макрофагів, яка зростала в 1,5 рази.

Отже, результати вивчення властивостей виготовленого ЛПС‑1 свідчать про те, що він є нешкідливим для тварин, має виражені стимулюючі властивості.

З метою визначення оптимальної дози ЛПС‑1, яка б забезпечувала активізацію імунної відповіді, здійснено подальші досліди на 6 групах кроликів (по 5 голів у кожній), яким вводили внутрішньом’язово препарат у дозах 1, 2, 5, 7 і 10 мкг/кг маси тіла тварин. Нагляд за піддослідними тваринами здійснювали впродовж 14 діб. Контрольній групі вводили фізіологічний розчин.

Установлено, що ЛПС‑1 активізує ланки клітинного імунітету. Імуномодулююча дія ЛПС‑1 виявлялась уже на 7 добу в тварин усіх груп, які отримували препарат незалежно від його дози, але різною мірою щодо реакції імунокомпетентних клітин. Найбільш виражена стимулююча активність ЛПС‑1 спостерігалася у групах кроликів, які отримували 5 і 7 мкг препарату з розрахунку на кілограм маси тіла. Зокрема стабільно й достовірно підвищувалася фагоцитарна активність, де фагоцитарне число й фагоцитарний індекс зростали до 9,05–9,08 і 9,05–10,45 одиниць відповідно проти 4,46 (у середньому) в контролі. Ці показники стимулювання імунокомпетентних клітин були близькими до результатів дії ЛПС‑1 у дозі 10 мкг/кг маси тіла кроликів. Виходячи з цього, було визнано доцільним застосування ЛПС‑1 у дозі 7 мкг/кг маси тіла тварини.

Отже, результати визначення оптимальної дози ЛПС‑1 дозволили встановити, що цей препарат може застосовуватися із розрахунку 7 мкг/кг маси тіла для підвищення резистентності організму тварин і стимуляції післявакцинального імунітету.

Вивчення імуногенності вакцини живої культуральної проти вірусної діареї на телятах. Імуногенність вакцини живої культуральної з атенуйованого штаму ВК‑1М вірусу діареї вивчали на телятах у неблагополучному щодо вірусної діареї дослідному господарстві «Українка Слобідська» згідно з наказом директора ІЕКВМ УААН № 7-б від 20 січня 2004 року.

Випробування запропонованої вакцини здійснювали за методикою, що була розглянута й схвалена методичною комісією ІЕКВМ УААН (протокол № 1 від 2 лютого 2004 року), згідно з якою в господарстві було сформовано 5 груп телят 3–4-місячного віку (по 5 голів у кожній). До застосування вакцини в телят усіх дослідних груп виявлені специфічні до вірусу діареї антитіла в титрах від 3,5 до 4,5 log₂ (рис. 1).

Першій групі телят вакцину щепили внутрішньом’язово дворазово з інтервалом у 14 діб у дозі 2Ч10^5,45 ТЦД₅₀/гол., а другій – 5Ч10^5,45ТЦД₅₀/гол., що відповідно містились у щепних об’ємах 2 і 5 см³. Телятам третьої групи вакцина в дозі 2Ч10^5,45 ТЦД₅₀/гол. була введена одночасно з ЛПС-1 із розрахунку 7 мкг/кг маси тіла тварин. Телята четвертої групи отримували лише ЛПС-1 у дозі 7 мкг/кг маси тіла. П’ята група телят була контрольною, якій ні вакцина, ні ліпополісахарид не щепили. Отримані дані свідчать про те, що вакцина позитивно впливала на динаміку імунної відповіді незалежно від вихідної серопозитивності телят до її застосування.

 

Рис. 1. Динаміка специфічних антитіл у телят, щеплених вакциною проти вірусної діареї в комплексі з ЛПС-1

Інтенсивність приросту титрів специфічних до вакцинного вірусу антитіл у телят залежала від щепної дози. Так, на 7 добу після введення вакцини в дозах 2 і 5 см³/гол. їх титр зростав на 1,75 і 2,0 log₂ відповідно, а на 28 добу він був вищим на 2,8 і 3,75 log₂ порівняно з вихідним (3,5 і 4,0 log₂).

Застосування ліпополісахариду суттєво підсилювало приріст титру антитіл за одночасного щеплення вакцини в дозі 2Ч10^5,45ТЦД₅₀/гол. у середньому на 2,0 log₂ відносно титрів антитіл у разі застосування однієї вакцини в цій дозі. Перевагу застосування вакцини в комплексі з ЛПС-1 підтверджено також стабільним утриманням високого рівня титру специфічних антитіл упродовж 60 діб з поступовим зниженням його до 7,5±0,23 log₂ на 180 добу, а також даними щодо титру нейтралізуючих антитіл у разі застосування однієї вакцини в дозі 5Ч10^5,45 ТЦД₅₀/гол., де він був у середньому на 1,5 log₂ нижчим.

У разі щеплення вакцини в комплексі з ЛПС-1 у сироватці крові телят збільшувався вміст загального білка, імуноглобулінів класів М і G, циркулюючих імунних комплексів, що свідчить про посилення показників неспецифічної резистентності.

Важливим моментом у виборі щепної дози вакцини було дослідження концентрації серомукоїдів, підвищення рівня яких було виявлено вже на 3 добу в телят, яким щепили препарат у дозі 5Ч10^5,45 ТЦД₅₀/гол., і майже в 3,5 рази на 14 добу після першого щеплення.

Підвищення рівня серомукоїдів свідчить про виражену імуносупресивну дію вакцини живої в дозі 5 см³ (5Ч10^5,45 ТЦД₅₀/гол.) на клітинну ланку імунітету, що збігається з даними F. A. Roth et al. (1983, 1986) і вказує на недоцільність застосування живої вакцини в такій дозі.

Отже, за результатами цього досліду встановлено, що випробувана вакцина проти вірусної діареї у разі введення телятам як окремо в дозах 2Ч10^5,45 ТЦД₅₀/гол. і 5Ч10^5,45 ТЦД₅₀/гол., так і в меншій дозі одночасно з ЛПС‑1 виявляє виражені імуногенні властивості. Вакцина, введена в дозі 2Ч10^5,45 ТЦД₅₀/гол. (2 см³) у комплексі з ЛПС‑1, викликає індукцію вірусонейтралізуючих антитіл у середньому на 2,0 log₂ вище порівняно з їх титрами, які виявляються під час застосування однієї вакцини в такій же дозі. Щеплення вакцини в комплексі з ЛПС‑1 позитивно впливає на всі ланки імунітету, в тому числі й неспецифічного. У той же час у разі застосування вакцини в дозі 5Ч10^5,45 ТЦД₅₀/гол. виявляється імуносупресивний ефект, що свідчить про недоцільність її введення телятам у цій дозі. Одночасне щеплення ЛПС‑1 з вакциною в дозі 2Ч10^5,45 ТЦД₅₀/гол. стимулює біосинтез факторів специфічної й неспецифічної резистентності, що свідчить про імуномодулюючу дію застосовуваного ліпополісахариду.

Вивчення профілактичної ефективності вакцини живої культуральної проти вірусної діареї у виробничих умовах. Виробниче комісійне випробування профілактичної ефективності вакцини здійснено в неблагополучному щодо вірусної діареї господарстві на 72 телятах 21–28-добового та 3–4-місячного віку, з яких були сформовані по 3 групи по 12 тварин у кожній. У досліді використали експериментальну серію вакцини живої культуральної проти вірусної діареї та імуномодулятор ЛПС-1, виготовлений з культури Bacіllus alvei, що були заздалегідь перевірені на стерильність та нешкідливість для тварин. Ліофілізований зразок вакцини мав інфекційність на рівні 5,45 lg ТЦД₅₀/см³.

У процесі вивчення динаміки імунітету встановлено, що в телят як перших (21–28-добового і 3–4-місячного віку), так і других груп, котрим щепили відповідно одну вакцину в дозі 2Ч10^5,45 ТЦД₅₀/гол. і вакцину в цій дозі в комплексі з ЛПС‑1 із розрахунку 7 мкг/кг маси тіла тварин, вже на 7 добу було виявлено зростання титру вірусонейтралізуючих антитіл до 3,2 і 4,3 log₂. Причому, титр вірусонейтралізуючих антитіл у телят 21–28-добового віку, котрим вакцину щепили в комплексі з ЛПС‑1, був вищим на 0,9 log₂ порівняно з введенням однієї вакцини. Після другого введення цих препаратів титр антитіл стабілізувався на рівні 6,4–8,0 log₂ і утримувався до 60 доби, після чого дещо знижувався до 5,3–7,1 log₂ на 180 добу.

У процесі щоденного клінічного нагляду та термометрії телят протягом перших 14 діб не було виявлено погіршення загального стану тварин, а також підвищення температури тіла. У подальшому не встановлено хворих тварин серед щеплених як однією вакциною, так і вакциною в комплексі з ЛПС-1, у той час як у контрольних групах телята перехворіли з ознаками ураження очей (гіперемія кон’юнктиви, сльозотеча) та слизової оболонки верхніх дихальних шляхів (слизовитікання з носа, кашель), а також підвищенням на 1,0–1,5 °С температури тіла, що спостерігались упродовж 2–3 тижнів, після чого клінічні ознаки поступово згасали. Температурна реакція була нестабільною, частіше реєструвалася надвечір протягом 7–12 діб. Клінічні ознаки були більш вираженими в телят молодшого віку.

Отже, результати комісійного випробування вакцини живої культуральної проти вірусної діареї великої рогатої худоби на телятах у виробничих умовах надали підставу вважати, що вона відповідає вимогам ТУУ за відсутністю контамінації сторонніми мікроорганізмами, високою антигенною активністю та здатністю індукувати імунітет в організмі щеплених нею телят, захищає їх від проявів клінічних ознак хвороби.

За результатами комісійного виробничого випробування вакцина жива культуральна проти вірусної діареї була рекомендована для впровадження в біофабричне виробництво та застосування для профілактики вірусної діареї у неблагополучних щодо цієї хвороби господарствах.

На підставі отриманих даних ми пропонуємо спосіб профілактики вірусної діареї ВРХ у неблагополучних господарствах шляхом застосування живої вакцини з атенуйованого вірусу штаму ВК–1М і ліпополісахариду з Bacillus alvei (ЛПС–1).

За результатами здійснених досліджень розроблено нормативну документацію на вакцину живу культуральну проти вірусної діареї великої рогатої худоби (інструкція з виготовлення й контролю якості, ТУУ та настанова із застосування), в подальшому розглянуту і схвалену методичною комісією ІЕКВМ УААН (протокол № 16 від 8 грудня 2004 р.) і подану на експертизу до ДНКІБШМ та узгодження до Державного департаменту ветеринарної медицини України.

ВИСНОВКИ

 

1. У дисертації подано експериментальне й практичне вирішення проблеми специфічної профілактики вірусної діареї великої рогатої худоби, а саме: створено живу культуральну вакцину та розроблено технологію її виготовлення. За результатами досліджень щодо вивчення тест-об’єкту для культивування вірусу діареї, його інфекційності, антигенних та імуногенних властивостей обрано клітинну систему і виробничий штам вірусу для напрацювання вихідної сировини з метою виготовлення вакцини. Створено препаративну форму вакцини живої культуральної проти вірусної діареї, обґрунтовано формування й корекцію післявакцинального імунітету, запропоновано комплексне застосування вакцини та імуномодулятора з бактеріального ліпополісахариду.

2. Розроблено живу культуральну вакцину проти вірусної діареї великої рогатої худоби з модифікованого штаму ВК-1М вірусу діареї, репродукованого в ролерній моношаровій культурі перещеплюваних клітин КСТ, з інфекційністю 5,45 lg ТЦД₅₀/см³, яку стабілізовано в процесі ліофілізації за допомогою 5,6 %‑ї сахарози і 2,8 %-го желатину (кінцеві концентрації). Вакцина не контамінована сторонніми мікроорганізмами, нешкідлива для тварин, слабореактогенна, призначена для щеплення великої рогатої худоби в неблагополучних господарствах.

3. Перещеплювані культури клітин ТрТ, ВНК-21/13 та КСТ мають високу проліферативну активність у процесі вирощування в суміші з рівних об’ємів поживних середовищ 199 та Ігла і 10 % нормальної сироватки крові великої рогатої худоби. Посівна концентрація з розрахунку 300 тисяч клітин/см³ поживного середовища забезпечує відповідно в 2,6; 4,8 і 4,9 рази вищий їх приріст за ролерного способу культивування, який скорочує на 20–48 годин термін накопичення біомаси клітин для напрацювання вихідної для виготовлення вакцини вірусної сировини порівняно зі стаціонарним у матрасах.

4. Виробничий штам ВК-1М вірусу діареї, адаптований до розмноження в культурі перещеплюваних клітин у ролерних бутлях, зберігає активну репродуктивну здатність і має високу інфекційність. Оптимальний час репродукції та титр його інфекційності становить у культурі перещеплюваних клітин ТрТ відповідно 46 годин і 7,05 lg ТЦД₅₀/см³, ВНК-21/13 – 64 години і 7,0 lg ТЦД₅₀/см³. Більш придатною для репродукції та накопичення біомаси штаму ВК-1М є перещеплювана культура КСТ, яка забезпечує його репродукцію впродовж 40 годин з інфекційністю 7,6 lg ТЦД₅₀/см³.

5. Щеплення вакцини живої культуральної проти вірусної діареї в об’ємах 2 і 5 см³, що вміщують відповідно 2Ч10^5,45 ТЦД₅₀ і 5Ч10^5,45 ТЦД₅₀ вакцинного вірусу, забезпечує в імунізованих телят індукцію вірусонейтралізуючих антитіл, які виявляються на 7 добу після введення препарату в титрах 5,0 і 6,0 log₂ відповідно, рівень яких зростає на 28 добу після повторного введення з інтервалом у 14 діб до 6,0 і 7,7 log₂, відповідно, та утримуються на цьому рівні до 60 доби, після чого на 180 добі дещо знижуються до 5,9 і 6,75 log₂.

6. Обґрунтовано та практично підтверджено в експерименті залежність імуногенності виробничого штаму ВК-1М від його інфекційності в щепному об’ємі та кратності введення. Установлено, що з підвищенням дози вірусу в щепному об’ємі від 0,5Ч10^5,45 ТЦД₅₀ до 1Ч10^5,45 ТЦД₅₀ для морських свинок і від 2Ч10^5,45 ТЦД₅₀ до 5Ч10^5,45ТЦД₅₀ для телят за дворазового введення зростає індукція вірусонейтралізуючих антитіл у 1,5 рази в порівнянні з одноразовим і становить 7,3 і 8,0 log₂ відповідно.

7. Вакцинний вірус (штам ВК-1М), у дозі 5Ч10^5,45 ТЦД₅₀ в щепному об’ємі виявляє імуносупресивні властивості, про що свідчить підвищення в 3,5 рази серомукоїдів у організмі щеплених проти вірусної діареї телят. Застосування бактеріального ліпополісахариду ЛПС-1, виготовленого з культури Bacillus alvei (штам 413), із розрахунку 7 мкг/кг маси тіла телят одночасно із щепленням вакцини живої культуральної проти вірусної діареї активізує як специфічні, так і неспецифічні фактори резистентності у тварин, чинить імунореабілітуючу дію на імунну систему, згладжує імуносупресивність і підвищує імунну відповідь на виробничий штам вірусу діареї з продукцією вірусонейтралізуючих антитіл на 2 log₂ вище порівняно з щепленням однієї вакцини в дозі 2Ч10^5,45 ТЦД₅₀/гол.

8. Запропоновано спосіб імунізації телят проти вірусної діареї в неблагополучних щодо цієї хвороби господарствах із застосуванням дворазового введення з інтервалом 14 діб внутрішньом’язово 2 см³ вакцини живої культуральної, що вміщує 2Ч10^5,45 ТЦД₅₀ виробничого штаму ВК-1М вірусу діареї, одночасно з ЛПС-1 з розрахунку 7 мкг/кг маси тіла тварини, що забезпечує формування гуморального імунітету, починаючи з 7-ї доби після щеплення, і захищає тварин від захворювання впродовж 180 діб (термін спостереження).

1. Вакцина жива культуральна проти вірусної діареї великої рогатої худоби та нормативна документація (інструкція з виготовлення та контролю за показниками якості вакцини живої культуральної проти вірусної діареї великої рогатої худоби, ТУУ на вакцину живу культуральну проти вірусної діареї великої рогатої худоби та листівка-вкладка із застосування вакцини живої культуральної проти вірусної діареї великої рогатої худоби), що розглянута й схвалена на засіданні методичної комісії ІЕКВМ УААН (протокол № 16 від 8 грудня 2004 р.). Досьє на вакцину подано на експертизу до ДНКІБШМ та узгодження до Державного комітету ветеринарної медицини України.

2. Спосіб профілактики вірусної діареї великої рогатої худоби, що передбачає одночасне застосування вакцини живої культуральної проти вірусної діареї та імуностимулюючого ліпополісахариду ЛПС-1, виготовленого з Bacillus alvei.

---

Дата добавления: 2019-09-02; просмотров: 84; Мы поможем в написании вашей работы!

Поделиться с друзьями:

---

---

Мы поможем в написании ваших работ!