ВЛИЯНИЕ ТЕМПЕРАТУРЫ НА РОСТ И МЕТАБОЛИЗМ МИКРООРГАНИЗМОВ
ПРАКТИЧЕСКАЯ РАБОТА № 1
ВЛИЯНИЕ ФИЗИЧЕСКИХ ФАКТОРОВ СРЕДЫ ОБИТАНИЯ НА ЖИЗНЕДЕЯТЕЛЬНОСТЬ МИКРООРГАНИЗМОВ
ЧАСТЬ 1
Цель работы: изучить особенности влияния физических факторов среды на жизнедеятельность микроорганизмов; выделить основные физиологические группы микроорганизмов по отношению к температуре.
В естественных условиях микроорганизмы подвергаются воздействию абиотических факторов, значительно различающихся по своей природе и механизму действия. Тем не менее характер зависимости показателей жизнедеятельности микроорганизмов от уровня различных внешних факторов сходен. Для любого абиотического фактора существует диапазон изменений, в пределах которого показатели жизнедеятельности микроорганизма практически не изменяются, оставаясь на уровне, называемом оптимальным. Данный интервал получил название зона оптимума. Более низкие уровни фактора не обеспечивают полноценное функционирование микроорганизма, ограничивая интенсивность процессов его жизнедеятельности, и соответствующий интервал называют зоной лимитирования. Избыточные уровни фактора подавляют жизнедеятельность микроорганизмов, и этот интервал называют зоной ингибирования. Существуют экстремально высокие и экстремально низкие уровни фактора, при которых жизнедеятельность микроорганизма становится невозможной. Крайние пределы изменений фактора, которые организм способен перенести, принято называть пределами толерантности. Разные микроорганизмы имеют значительно отличающиеся пределы толерантности к одному и тому же экологическому фактору.
|
|
|
В большинстве случаев отношение микроорганизма к тому или иному абиотическому фактору отражают на графике зависимости роста от интенсивности фактора. При этом определяют так называемые кардинальные точки: оптимальное значение (или область значений), обеспечивающее наилучший рост, минимальное и максимальное значения, при которых рост прекращается. Диапазон между минимальным и максимальным значениями составляет область толерантности, в ней (вне зоны оптимума) микроорганизм активен, но имеет низкую конкурентоспособность и может быть вытеснен другими организмами. Область толерантности микроорганизма к определенному фактору может быть узкой или широкой. Организмы с широкими пределами толерантности называют эврибионтами, а организмы, способные существовать в относительно узких пределах изменений экологического фактора, - стенобионтами. Для стенобионтов следует принимать во внимание положение зоны их оптимума на шкале возможных изменений данного фактора. Например, среди стенотермных микроорганизмов различают психрофилы, температурный оптимум которых находится в области низких температур (0-4 °С), и термофилы с высокой оптимальной температурой роста (70 °С и выше).
|
|
|
Физико-химические условия обитания микроорганизмов в природе имеют достаточно широкий диапазон. Повсеместно распространенные условия называют обычными, или нормальными, а крайние значения факторов - экстремальными.
Температура - один из важнейших факторов внешней среды, влияющий на микроорганизмы. Действие " температуры на рост микроорганизмов обусловлено ее воздействием на скорость химических реакций в клетке и состояние клеточных макромолекул (вязкость мембран, конформация белков и др.). Повышение температуры выше критического уровня ведет к необратимой инактивации клеточных компонентов, в первую очередь денатурации белков и нуклеиновых кислот, и гибели микроорганизма. Для оценки летального эффекта температуры на клетки микроорганизмов используют количественные параметры:
термическую точку отмирания (ТТО) - температуру, при которой данный организм погибает за 10 минут, и термическое время отмирания (ТВО) - время, за которое данный организм погибает при определенной температуре. Нижние пределы роста микроорганизмов ограничены температурой «застывания» мембраны, когда она теряет текучесть и перестает выполнять свои функции. При снижении температуры ниже минимального уровня микроорганизмы не погибают и могут в течение длительного времени сохранять жизнеспособность. При пониженной температуре снижается не только скорость роста, но и скорость отмирания микроорганизмов, и, соответственно, увеличивается их выживаемость. Поэтому замораживание микроорганизмов при низкой и сверхнизкой температуре (-20, -70, -196 °С) широко используется для длительного хранения.
|
|
|
Микроорганизмы встречаются в местах с различными температурными режимами. К низкотемпературным местам обитания микроорганизмов относятся регионы Арктики, Антарктики, тундра, глубины океанов, где температура имеет постоянное значение около 4 °С. Высокотемпературные места обитания - гейзеры, вулканические источники, горячие источники, «черные курильщики» (гидротермальные источники срединно-океанических хребтов) - выход вулканических горячих газов на разломах земной коры, где температура при высоком давлении может достигать 360 °С.
По отношению к температуре микроорганизмы подразделяют на несколько групп (рис. 2):
|
|
|
▪ мезофшы - растут при умеренной температуре. У многих из них температурный оптимум близок к температуре тела теплокровных животных (30-37 °С) или немного ниже (20-25 °С). Максимальная температура роста свободноживущих мезофилов составляет 45-50 °С и близка к максимальной температуре нагрева почвы. Большинство известных микроорганизмов являются мезофилами, в том числе излюбленный объект микробиологических исследований Escherichia coli;
▪ психрофилы - растут при температуре ниже 20 °С, вплоть до отрицательной температуры, оптимальная температура роста у них ниже 15 °С. К психрофильным микроорганизмам можно отнести представителей вида Bacillus psychrophilus, железобактерии рода Galionella. Психрофилы обитают в стабильно холодных условиях и чрезвычайно чувствительны даже к незначительному повышению температуры. Одна из причин психрофилии - тепловая денатурация клеточных белков при умеренной температуре (выше 20 °С). Для психрофилов характерен особый состав мембран с пониженной точкой замерзания. Они содержат больше ненасыщенных, короткоцепочечных и разветвленных жирных кислот и меньше циклических жирных кислот.
Температурный оптимум
▪ психротрофы - способны расти при 0 °С, однако по сравнению с психрофилами имеют более высокую оптимальную (20-30 °С) и максимальную (35 °С) температуру роста. К данной группе относят представителей некоторых видов Pseudomonas и Arthrobacter. Психротрофы приспособлены к сезонным изменениям климата и имеют селективные преимущества перед стенотермными видами, поскольку метаболически активны и в теплое, и в холодное время года. Многие из них - типичные обитатели холодильников, вызывающие порчу замороженных продуктов. Приспособление психротрофов к пониженной температуре проявляется в изменении состава мембран (увеличение содержания ненасыщенных жирных кислот) и синтезе внутриклеточных криопротекторов (например, глицерола). Другой механизм адаптации связан с накоплением в клетках психротрофов больших количеств жизненно важных ферментов, функционирование которых позволяет клетке поддерживать достаточную активность даже при неоптимальной температуре. Психрофильные и психротрофные микроорганизмы играют важную роль в природных процессах в зоне холодного и умеренного климата. При исследовании метаногенного сообщества тундры группой российских ученых впервые обнаружено переключение трофического маршрута сообщества в зависимости от температуры, обусловленное сменой доминирующей группы микроорганизмов. При температуре выше 15 °С основным конечным процессом в сообществе был метаногенез, а ниже 15 °С - образование ацетата;
▪термофилы - микроорганизмы, оптимальная температура роста которых выше 50 °С. В зависимости от «кардинальных» точек температурного диапазона их подразделяют на следующие группы:
термотолерантные (температурный максимум - 45-50 °С),
факультативные (максимум - 50-65 °С),
облигатные (максимальная температура роста до 70 °С) и
экстремальные (оптимальная температура роста - 70-75 "С, максимальная - 90 °С) термофилы.
Примером термотолерантных микроорганизмов являются бактерии вида Methylococcus capsulatus; факультативных термофилов – гомоферментативные молочнокислые бактерии рода Lactobacillus; облигатных термофилов - представители вида Bacillus stearothermophilns: экстремальных термофилов - бактерии родов Thermus, Thermomicrobium , Thermoplasma. Рекорд выживаемости при повышенной температуре отмечается у архей, отдельные культуры которых растут на питательных средах при температуре выше 110 °С. Например, Methanopyrus kandleri растет при 122 °С - рекордно высокой температуре для всех известных организмов. У термофилов обнаружены высокотемпературные стабильные белки, термостабильные рибосомы, мембранные липиды содержат больше гликолипидов и тугоплавких насыщенных жирных кислот, ДНК и РНК ГЦ-типа. Ферменты термофилов более устойчивы к нагреванию по сравнению с аналогичными ферментами мезофилов, что в большинстве случаев обусловлено изменением первичной структуры белковой молекулы.
Термофильные микроорганизмы имеют огромное практическое значение. Они являются активными продуцентами ферментов, витаминов, органических кислот, кормового белка, используются для биологической очистки бытовых отходов с образованием биогаза.
Гидростатическое давление. Большинство микроорганизмов, живущих на поверхности земли или воды, не подвергаются значительным изменениям давления и растут при давлении около 1 атм. Однако существуют места, где давление значительно отличается от атмосферного. Повышенное давление в природе наблюдается в глубоких нефтяных скважинах (как правило, с высоким содержанием серы) и в глубинных зонах океанов, которые обычно характеризуются низкой температурой и малым содержанием питательных веществ. Микроорганизмы обнаружены в самом глубоком месте Мирового океана - Марианской впадине - при давлении ~1016 атм. Самое высокое искусственно созданное давление, при котором сохраняются микроорганизмы, - 1400 атм.
Повышение гидростатического давления приводит к разрушению клеточных структур и денатурации белков. В условиях повышенного давления клетки микроорганизмов перестают делиться, не расходятся после деления и приобретают нитевидную форму.
По отношению к высокому давлению микроорганизмы подразделяют на следующие группы:
▪пьезочуествительные (барочувствительные) - микроорганизмы (обычно с газовыми вакуолями), которые при повышенном гидростатическом давлении перестают расти;
▪пьезотолерантные (баротолерантные) - микроорганизмы, выдерживающие давление до 400 атм., способные расти при обычном давлении;
▪пьезофильные (барофшьные) - микроорганизмы, нуждающиеся для роста в повышенном давлении.
Умеренные барофилы выдерживают давление до 850 атм., а экстремальные - выше 1000 атм.
Микроорганизмы подвержены действию различных видов электромагнитных излучений. В зависимости от длины волны электромагнитные излучения подразделяют на ионизирующее (до 10 нм), ультрафиолетовое (10-400 нм), инфракрасное (700-1100 нм) и видимую область (300— 700 нм). Излучение может оказывать на микроорганизмы следующее воздействие:
1) физиологическое; 2) летальное и мутогенное; 3) тепловое и механическое.
Физиологическое действие оказывают ближний ультрафиолет, видимый свет и инфракрасные лучи (350-400-800-1100 нм). Инфракрасные лучи проявляют тепловое действие на микроорганизмы и используются зелеными и пурпурными бактериями в процессе фотосинтеза. Видимая часть спектра применяется для фотосинтеза цианобактериями и другими фототрофными бактериями. Разные фототрофные микроорганизмы поглощают свет различной длины волны. Пределы используемого спектра света определяются, с одной стороны, необходимостью наличия энергии для фотохимических реакций, с другой - необходимостью предотвращения деструкции пигментов. Электромагнитные волны важны для проявления фототаксиса. Существуют фотозависимые синтезы и у нефотосинтезирующих микроорганизмов ' (например, образование каротиноидов у микобактерий). Однако видимый свет и инфракрасное излучение не всегда положительно влияют на микроорганизмы. Под воздействием инфракрасных лучей может происходить перегрев клетки, а видимый свет в аэробных условиях приводит к образованию синглетного кислорода, что вызывает фотоокисление клеточных ферментов. В качестве защиты микроорганизмы синтезируют каротиноиды, служащие «тушителями» синглетного кислорода.
Ультрафиолет в зависимости от длины волны и дозы может оказывать на микроорганизмы летальный или мутагенный эффект. Наибольший летальный эффект УФ-лучей наблюдается при длине волны 260 нм, при которой происходит максимальное поглощение данного излучения молекулами ДНК. Летальное действие ультрафиолета обусловлено в первую очередь изменениями структуры ДНК (разрывом водородных связей, расщеплением связей между дезоксирибозой и фосфатом, образованием циклобутановых димеров тиминовых оснований, располагающихся в одной цепи), приводящими к ингибированию процессов репликации и транскрипции. Тиминовые димеры могут быть устранены двумя путями: фотореактивацией и темновой репарацией. В первом случае повреждения ДНК исправляются одним ферментом, активируемым видимым светом и устраняющим связи между тиминовыми основаниями в димерах. Во втором случае свет не нужен, и работают несколько ферментов: нуклеаза (вырезает поврежденный участок), ДНК-полимераза (синтезирует правильную структуру по комплементарной цепи) и лигаза (восстанавливает фосфодиэфирную связь).
Ультрафиолет с длиной волны 325-400 нм также вреден для микроорганизмов, поскольку наряду с формированием тиминовых димеров происходит разрушение триптофана и образование его токсичных фотопродуктов, действующих как химические мутагены. К воздействию ультрафиолета наиболее устойчивы микроорганизмы, в клетках которых содержатся каротиноиды. У гетеротрофных микроорганизмов каротиноиды служат защитной системой, уменьшающей повреждения нуклеиновых кислот, а у фототрофных бактерий они предохраняют бактериохлорофилл от фотоокисления.
При оценке зависимости выживаемости микроорганизмов от дозы УФ-облучения большое значение имеет плотность бактериальной суспензии. УФ-лучи интенсивно поглощаются бактериальной клеткой, поэтому при высокой концентрации клетки могут экранировать друг друга. Последнее обстоятельство не играет существенной роли в бактериальных суспензиях, в которых плотность не превышает 108 клеток/мл. При использовании густой бактериальной суспензии во время облучения ее необходимо постоянно перемешивать. Бактериальную суспензию следует распределять тонким слоем, поскольку УФ-лучи характеризуются низкой проникающей способностью, в силу чего клетки, располагающиеся более глубоко, не подвергаются их воздействию. Выживаемость клеток при действии УФ-излучения зависит от состава среды, используемой для их суспендирования. Облучение лучше всего проводить в буферных растворах. Жидкая полноценная питательная среда поглощает УФ-лучи интенсивнее, чем буферные растворы, поэтому получаемая клетками доза облучения уменьшается. В то же время при облучении в питательной среде могут образовываться токсические продукты, увеличивающие летальный эффект УФ-лучей, что затрудняет интерпретацию результатов. Летальный эффект УФ-лучей зависит от физиологического состояния, прежде всего возраста, бактериальной культуры. Клетки более чувствительны к действию УФ-лучей в экспоненциальной стадии роста.
Ионизирующее излучение - очень короткие волны с высокой энергией. Низкие уровни ионизирующего излучения могут вызывать у микроорганизмов мутации, а высокие почти всегда приводят к гибели. Основные повреждения клеток вследствие ионизирующего излучения включают разрушения водородных связей и кольцевых структур биологических молекул, их полимеризацию. В отличие от УФ-лучей ионизирующее излучение действует на биополимеры не напрямую, а опосредованно, вызывая образование свободных радикалов и органических перекисей, которые реагируют с нуклеиновыми кислотами и белками, приводя к однонитевым и двунитевым разрывам цепей ДНК, изменениям азотистых оснований, окислению сульфгидрильных групп белков в дисульфидные.
Присутствие кислорода значительно усиливает действие ионизирующего излучения, вероятнее всего, из-за образования гидроксил-радикалов (ОН●). Микроорганизмы различных таксономических групп существенно отличаются чувствительностью к ионизирующему излучению. Например, бактерии Clostridium botulinum сохраняют жизнеспособность при дозе 1,5 Мрад, Escherichia coli — 0,18 Мрад. Существуют микроорганизмы, выделенные из облученных продуктов, воды атомных реакторов, залежей урановых руд, - Deinococcus radiodurans, Shizosaccharomyces pomhe, устойчивые к дозе ионизирующего излучения в 2-3 Мрад, что объясняется наличием в их клетках мощных репарационных систем, исправляющих повреждения ДНК. Поскольку ультрафиолет и ионизирующее излучение в определенных дозах губительны для микроорганизмов, их используют для стерилизации.
Ультразвук - высокочастотные (~25 кГц) механические колебания упругой среды, не воспринимаемые органами слуха. При воздействии на микроорганизмы ультразвук создает большую разницу в давлении на отдельные части клетки, повреждая ее: разжижается и вспенивается цитоплазма, содержимое клетки смешивается с внешней средой. Чувствительность микроорганизмов к ультразвуку пропорциональна частоте колебаний, длительности воздействия и зависит от структурных особенностей и физиологического . состояния клетки. Чем крупнее клетка, тем более она чувствительна к ультразвуку; палочки и извитые формы более чувствительны, чем кокки. При длительном воздействии ультразвука наблюдается полная гибель микроорганизмов, что используется в целях стерилизации. Ультразвук применяют также для разрушения бактериальных клеток с целью извлечения из них биологически активных веществ.
На развитие микроорганизмов оказывает воздействие изменение напряжения магнитного поля. Этот фактор в настоящее время рассматривается как экологический, определяющий протекание многих биологических процессов. Особенно чувствительны к изменению напряжения магнитного поля микроорганизмы, содержащие в клетках магнитосомы.
Следует отметить, что в природе микроорганизмы испытывают влияние не одного, а множества абиотических факторов (температура, свет, давление и др.), поэтому необходимо учитывать взаимодействие факторов друг с другом. Для каждого абиотического фактора, вызывающего необратимые изменения биомолекул большинства микроорганизмов, существует группа высокоспециализированных прокариот, оптимально развивающихся при экстремальных значениях определенного фактора.
Контрольные вопросы
1. На какие физиологические группы по отношению к температуре делят микроорганизмы?
2. Приведите пример низкотемпературных и высокотемпературных мест обитания микроорганизмов.
3. Каков механизм действия на микроорганизмы высокой и низкой температуры?
4. Перечислите морфологические и биохимические особенности термофилов и психрофилов.
5. На какие группы по отношению к гидростатическому давлению делятся микроорганизмы?
6. Перечислите повреждения клеток микроорганизмов, вызываемые повышенным гидростатическим давлением.
7. Какое действие оказывают на микроорганизмы излучения с разной длиной волны?
8. Перечислите основные повреждения прокариотической клетки, вызываемые УФ-излучением, и механизмы их репарации.
9. Назовите основные механизмы повреждающего действия ионизирующего излучения на микроорганизмы.
10. Какие факторы влияют на чувствительность микроорганизмов к ультразвуку?
11. Какие микроорганизмы наиболее чувствительны к изменению напряжения магнитного поля?
12. Приведите пример природного местообитания микроорганизмов, в котором сочетаются экстремальные значения нескольких абиотических факторов.
ЧАСТЬ 2
ВЛИЯНИЕ ТЕМПЕРАТУРЫ НА РОСТ И МЕТАБОЛИЗМ МИКРООРГАНИЗМОВ
Цель работы: изучить влияние температуры культивирования на рост и метаболизм микроорганизмов разных систематических групп.
Материалы и оборудование: пептонно-дрожжевой агар (ПДА), пептонно-дрожжевой бульон (ПДБ), стерильные чашки Петри, стерильные пробирки, стерильные пипетки на 1-2 и 5-10 мл, автоматический дозатор на 2-20 мкл, наконечники на 2-200 мкл, микробиологическая петля, стерильные шпильки, спиртовка, термостаты на 4, 10, 18, 28, 37, 42, 55 °С, вортекс, спектрофотометр или фотоколориметр.
Ход работы
1. Продукция красного пигмента (продигиозина) бактериями Serratia marcescens в зависимости от температуры культивирования. Все серрации хорошо растут при температуре 15-30 °С. На КА (кровяном агаре) при 37 °С S. marcescens образуют серовато-белые прозрачные S-колонии 1-2 мм в диаметре, колонии могут быть гладкими или мелкозернистыми. При комнатной температуре через 24-48 ч колонии серрации становятся красными. На скошенном агаре серрации образуют гладкий белый налёт. Поскольку большинство изолятов серрации не ферментирует лактозу, то на среде Плоскирева они образуют бесцветные колонии. S. marcescens резистентны к действию колистина и могут расти на средах с его включением. Культура серрации издаёт ароматный запах, напоминающий запах карамели. Биохимические свойства серрации представлены в табл. 18-1.
1) Культуру S. marcescens засевают в две пробирки со скошенным ПДА.
2) Одну пробирку помещают в термостат при 28 °С, вторую - при 37 °С, инкубируют в течение 24-48 ч.
3) Продукцию красного пигмента (продигиозина) сравнивают при различной температуре - культивирования.
4) Результаты записывают в лабораторный журнал, делают вывод о влиянии температуры культивирования на продукцию продигиозина.
Дата добавления: 2018-11-24; просмотров: 1174; Мы поможем в написании вашей работы! |
Мы поможем в написании ваших работ!