Методы выделения анаэробных микроорганизмов
Основаны на выращивании микроорганизмов в средах с низкой концентрацией кислорода или в безкислородной среде, что достигается:
– посевом исследуемого материала в среды, содержащие редуцирующие и легко окисляемые вещества (антиоксиданты). В качестве таких веществ чаще всего используют тиогликолят натрия, солянокислый цистеин, кусочки животных и растительных тканей;
– посевом исследуемого материала в глубину плотных питательных сред. Посев делается уколом препаровальной иглой в пробирку со столбиком плотной среды или в расплавленную плотную или полужидкую питательную среду с последующим перемешиванием;
– механическим удалением воздуха из сосудов при выращивании анаэробных микроорганизмов (создают вакуум);
– культивированием анаэробных микроорганизмов в жидких средах под слоем масла;
– культивированием анаэробных микроорганизмов в атмосфере инертного газа, диоксида углерода, азота.
Техника проведения посевов.
Посев на плотные среды в чашки проводят несколькими способами.
Поверхностный способ посева удобен для посева микроорганизмов из жидкой суспензии на твердую среду. Метод применяется для определения числа жизнеспособных клеток в пробе после серийных разведений. Его можно использовать также для получения сплошного «газона» микроорганизмов на поверхности агара после густого посева. Это удобно при анализе активности ингибиторов, таких как антибиотики или дезинфицирующие вещества, которые добавляют в сделанные в агаре углубления либо наносят на диски из фильтровальной бумаги, размещенные на поверхности агара. Ингибитор диффундирует через агар, образуя зону подавления роста вокруг отверстий или дисков фильтровальной бумаги, которая видна после инкубации. Диаметр зоны может служить мерой степени ингибирования.
|
|
|
Для переноса пробы из жидкой среды, например воды, молока или бульона, в пробирку с питательной средой используют проволочную петлю. Петлю погружают в среду и мягко взбалтывают ее, не забывая каждый раз прокаливать горлышко флакона.
Последовательность действий:
Готовят в чашках Петри твердые пластинки из питательной среды. Стерильную твердую питательную среду расплавляют на водяной бане в пробирке или колбе и охлаждают до температуры 50 °С.
Вынимают чашки Петри из бумаги, в которой они стерилизовались, и ставят их на ровную горизонтальную поверхность.
Берут пробирку или колбу с охлажденной до 50 °С питательной средой, вынимают ватную пробку, обжигают на пламени горелки края пробирки и держат ее в наклонном положении. Приоткрывают крышку чашки Петри левой рукой, а правой рукой наливают среду на дно чашки Петри, заполняя всю ее поверхность.
|
|
|
Оставляют чашку Петри на столе до полного застывания среды, затем ставят в термостат на 15-20 мин для подсушивания.
На твердую среду посевной материал наносят петлей или пипеткой. Затем каплю посевного материала равномерно распределяют по поверхности, пользуясь стерильным шпателем (изогнутой стеклянной палочкой). Для этого, шпатель вынимают из бумаги и берут в правую руку.
Приоткрывают крышку чашки Петри левой рукой и вносят в нее шпатель.
Размазывают каплю посевного материала шпателем вращательными движениями по поверхности агаровой пластинки (надавливать шпателем на твердую среду не следует, так как можно ее повредить).
Переносят шпатель в сосуд с дезинфицирующим раствором.
Посев заливкой – метод, альтернативный методу посева на поверхность агара, используется для инокуляции клеток из жидкой культуры, а также для подсчета жизнеспособных клеток. Поскольку клетки распределены по всей среде, а не только по поверхности агара, можно подсчитать гораздо большее их количество – до 1000 колоний на чашку. Однако размеры выросших колоний значительно меньше.
Для этого, определенный объем (до 0,5 см3) клеточной суспензии вносят в простерилизованный флакон, подходящего объема (около 15-20 см3) с расплавленным в нем питательным агаром, который предварительно был охлажден до 45-50 °С в водяной бане. Снимают крышку и перед добавлением клеточной суспензии прожигают горлышко флакона. Суспензию клеток тщательно перемешивают с питательным агаром, поворачивая (не встряхивая) назад и вперед зажатый в ладонях флакон. Затем выливают смесь в стерильную чашку Петри. Подписывают донышко чашки и инкубируют ее.
|
|
|
Используется и другой вариант посева в жидкую среду, так называемый глубинный способ посева.
Приоткрывают стерильную чашку Петри и помещают петлей или пипеткой каплю посевного материала на дно чашки.
Расплавляют агаризованную питательную среду в пробирке или колбе и охлаждают ее до 45-48 °С.
Обжигают края пробирки или колбы в пламени горелки и выливают среду в чашку Петри с внесенным посевным материалом, соблюдая правила стерильной работы.
Распределяют равномерно посевной материал в питательной среде, для чего осторожно круговыми движениями перемещают чашку Петри по поверхности стола.
Оставляют чашку Петри на столе до полного застывания среды.
Делают на чашке Петри надпись (число, название микроорганизма).
|
|
|
Посев уколом используют для культивирования анаэробных организмов или организмов, растущих при низкой концентрации кислорода (микроаэрофилов). Обычно используют пробирку с питательной агаризованной средой. Благодаря небольшой поверхности и достаточно большой глубине агара в пробирке по сравнению с чашкой доступ кислорода внутрь агара ограничивается. Посев производят прямой проволочкой (без петли), или бактериологической иглой. Небольшое количество культуры (твердой или жидкой) берут кончиком иглы и затем вертикально прокалывают ею агар. Культура растет в агаре во все стороны от линии прокола.
Все посевы, выполненные описанными способами, помещают в термостат для выращивания микроорганизмов при температуре, благоприятной для их роста.
Вопросы для обсуждения.
1 Какие известны виды культур микроорганизмов?
2 Какие используются методы культивирования микроорганизмов?
3 Как осуществляется техника посевов микроорганизмов?
Дата добавления: 2018-11-24; просмотров: 291; Мы поможем в написании вашей работы! |
Мы поможем в написании ваших работ!